韓俊 王建軍 龍光強(qiáng) 沈雪梅 余珊

摘要 [目的]應(yīng)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，篩選通關(guān)藤增殖培養(yǎng)基。[方法]以通關(guān)藤的誘導(dǎo)苗為試驗(yàn)材料，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案研究培養(yǎng)基、6-BA（細(xì)胞分裂素）、NAA（萘乙酸）及不同接種部位4個(gè)試驗(yàn)因子對(duì)通關(guān)藤增殖苗生長(zhǎng)狀況和增殖率的影響。[結(jié)果]篩選出通關(guān)藤最佳增殖培養(yǎng)基方案為MS+0.5? mg/L 6-BA+0.3? mg/L NAA+25 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂+莖尖。[結(jié)論]該研究為通關(guān)藤規(guī)?；a(chǎn)提供一定的技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞 通關(guān)藤;增殖培養(yǎng)基;組織培養(yǎng);激素;正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào) S567文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）13-0163-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.13.050

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract [Objective]The orthogonal experiment design method was used to screen the proliferation medium of Marsdenia tenocissima.[Method]The induced seedlings of Marsdenia tenocissima were used as experimental materials， and the effects of four test factors of 6-BA （cytokinin）， NAA （naphthaleneacetic acid） and different inoculation sites on the growth status and proliferation rate of proliferation seedlings of Marsdenia tenocissima were studied by L9（34） orthogonal design.[Result]The optimal proliferation medium of Marsdenia tenocissima was MS+0.5? mg/L 6-BA+0.3? mg/L NAA+25 g/L sucrose+7 g/L agar+stem tip.[Conclusion]This research provides certain technical support for for scale production of Marsdenia tenocissima.

Key words Marsdenia tenocissima;Proliferation medium;Tissue culture;Hormone;Orthogonal text

基金項(xiàng)目 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81660636）;云南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2016RA009）。

作者簡(jiǎn)介 韓?。?972—），女，云南硯山人，講師，碩士，從事中藥功效及藥用植物生理生化研究。*通信作者，副教授，碩士，碩士生導(dǎo)師，從事藥用植物生理生化研究。

收稿日期 2019-02-22;修回日期 2019-03-11

通關(guān)藤（Marsdenia tenocissima （Roxb）Wight et Arm）為蘿藦科牛奶藤屬多年生攀援木質(zhì)藤木植物，廣泛分布于熱帶及亞熱帶地區(qū)的云南、廣東、福建、臺(tái)灣、貴州等地，又名烏骨藤、奶漿藤、通光散等，為傣族、壯族、苗族常用藥物[1]。通關(guān)藤始載于《滇南本草》， 其味苦，性微甘，具有消炎止痛、清熱解毒、止咳平喘等作用[2]。通關(guān)藤中含有機(jī)酸、多糖、生物堿、樹脂、色素及甾體苷等化學(xué)成分，其中C21甾體類是其主要的化學(xué)成分，被現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為是具有抗腫瘤作用的最為主要的活性物[3-4]?，F(xiàn)代研究表明，通關(guān)藤還具有清熱、消炎、止咳、降壓、保肝、抗癌等功效[5]。

臨床采用通關(guān)藤總苷片及通光素，通關(guān)藤苷元甲治療慢性氣管炎[6]。目前通關(guān)藤在食管癌、宮頸癌、急性白血病等多種癌癥的治療方面也具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[7]。

通關(guān)藤市場(chǎng)需求量大，生產(chǎn)上的原材料僅來(lái)自于野生資源和自然繁育，加上通關(guān)藤自身花多果少的生物特性導(dǎo)致的較低自然繁殖力，致使通關(guān)藤資源的日漸枯竭?，F(xiàn)多采用萌發(fā)通關(guān)藤種子與扦插的方法緩解該困境。但通關(guān)藤種子外圍有一層堅(jiān)硬的種皮，萌發(fā)前需要浸種處理，但浸種時(shí)間過長(zhǎng)可能會(huì)使種子的細(xì)胞壁過分吸水，使得種子內(nèi)水分過多而引起一些活力較差的種子因?yàn)槿毖醵癄€，進(jìn)而導(dǎo)致發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)都明顯下降[8]，而且通過種子繁育得到的實(shí)生苗品種易退化，并存在生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、結(jié)實(shí)率低的弊端。其次在扦插繁育方面，采用河沙+泥炭+珍珠巖（3∶4∶3）的基質(zhì)的辦法來(lái)解決扦插時(shí)通關(guān)藤對(duì)保水性[9]、透氣性和保溫性的要求很不便捷，雖然有成活率較高的優(yōu)點(diǎn)，但后期感病嚴(yán)重，因此難以滿足市場(chǎng)需要。因此尋求一種便捷、適宜規(guī)模化生產(chǎn)的通關(guān)藤繁育方法具有很強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)性和長(zhǎng)遠(yuǎn)意義。組織培養(yǎng)技術(shù)是一種快速而又易于操作的人工繁育手段，為解決當(dāng)前的通關(guān)藤野生資源枯竭提供了一條解決途徑。該試驗(yàn)通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，通過基本培養(yǎng)基、6-BA、NAA及不同部位外植體對(duì)通關(guān)藤增殖苗生長(zhǎng)狀況及增殖率影響的研究，篩選出通關(guān)藤的最佳配方，以期為大規(guī)模的工廠生產(chǎn)提供一定的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

通關(guān)藤試驗(yàn)材料取于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院組培室培育的健壯誘導(dǎo)苗。

1.2 試驗(yàn)方法

采用正交試驗(yàn)方法設(shè)計(jì)基本培養(yǎng)基、6-BA、NAA及不同部位外植體4個(gè)試驗(yàn)因子，每個(gè)因子3個(gè)水平共9個(gè)處理。以B5、 MS、1/2MS為基本培養(yǎng)基，以2.5%（25 g/L）蔗糖為碳源，以7%（7 g/L）瓊脂固化，加熱至沸騰后加入6-BA與NAA，定容至1 L后調(diào)試pH為5.8;分裝完畢后在溫度121 ℃、壓強(qiáng)103.4 kPa下消毒30 min，30 min后轉(zhuǎn)入無(wú)菌接種室，靜置3～5 d備用。接種前4 h打開接種室紫外燈消毒，接種前穿戴口罩、實(shí)驗(yàn)服、拖鞋并進(jìn)行全身消毒;操作前對(duì)操作臺(tái)及試驗(yàn)器皿進(jìn)行消毒處理，選取健壯無(wú)菌通關(guān)藤誘導(dǎo)苗莖段為接種材料，自基部將誘導(dǎo)苗莖段按梢部、中部、基部剪為帶一個(gè)芽的莖段;分別將接種材料垂直插入培養(yǎng)基中;每個(gè)處理重復(fù)5瓶，每瓶接種3個(gè)。在溫度（25±2）℃、12 h/d光周期、12 h/d暗周期、2 000～2 500 lx光照強(qiáng)度下培養(yǎng)，培養(yǎng)50 d觀察并記錄莖粗、莖高及芽的生長(zhǎng)狀況。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 運(yùn)用SPSS正交設(shè)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，運(yùn)用SSR法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

通關(guān)藤增殖苗不定芽培養(yǎng)7～10 d均開始萌發(fā)，長(zhǎng)出嫩黃綠色的小葉，以后隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加逐漸轉(zhuǎn)為綠色。隨著莖不斷地長(zhǎng)長(zhǎng)、長(zhǎng)粗，形成新的枝條。在培養(yǎng)過程中每5 d對(duì)增殖苗的長(zhǎng)勢(shì)及葉子顏色變化進(jìn)行描述記錄。到50 d時(shí)測(cè)量莖粗、莖高，計(jì)算增殖率，并進(jìn)行綜合評(píng)定，結(jié)果見表1～2和圖1。

從表2可以看出，第4個(gè)處理（A2B1C2D1）無(wú)論是平均芽粗、平均芽高和增殖率都是相對(duì)最高的，芽葉的顏色也是最為嫩綠的，整個(gè)芽生長(zhǎng)狀況的綜合評(píng)價(jià)都是優(yōu)。其次是第5個(gè)處理（A2B2C3D2）和第3個(gè)處理（A1B3C3D3），無(wú)論是平均芽粗、平均芽高和增殖率都較好，其余綜合評(píng)價(jià)較差。

2.1 方差分析 經(jīng)方差分析，培養(yǎng)基（A）、6-BA（B）、NAA （C）、外植體（D）對(duì)增殖苗的芽粗、芽高和芽的增殖率均存在極顯著的相關(guān)性，A、C、D對(duì)芽粗和增殖率生長(zhǎng)影響均比較大，B的影響最小;A、B、D 對(duì)芽高生長(zhǎng)影響較大，C的影響最小。A、B、C、D 4個(gè)因子的主效應(yīng)差異均達(dá)到極顯著水平，即每個(gè)因子的各個(gè)水平間對(duì)平均芽粗、平均芽高、增殖率都是存在極顯著差異。其中4個(gè)因子對(duì)通關(guān)藤芽生長(zhǎng)狀況的平均芽粗和增殖率影響大小依次是A>D>C>B;對(duì)通關(guān)藤的生長(zhǎng)狀況芽高影響大小依次是 A>D>B>C。

2.2 主效應(yīng)的多重比較 結(jié)果表明，A2即基本培養(yǎng)基（MS）對(duì)平均芽粗、平均芽高和增殖率有極顯著差異，優(yōu)于A1和A3;B2即1.0 mg/L 6-BA對(duì)平均芽粗、平均芽高和增殖率有極顯著差異，優(yōu)于B1和B3;C3即0.5 mg/L NAA對(duì)平均芽粗、平均芽高和增殖率有極顯著差異，優(yōu)于C1和C2;D2即莖段中部對(duì)芽粗、芽高和增殖率有極顯著差異，優(yōu)于D1和D3。

2.3 各處理間的多重比較 方差分析結(jié)果顯示9個(gè)處理間效應(yīng)差異極顯著，各個(gè)處理間對(duì)芽粗、芽高和增殖率影響的多重比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可從各處理間找出最優(yōu)組合。從9個(gè)處理間效應(yīng)的多重比較（表2）可以看出，第4個(gè)處理A2B1C2D1（MS+0.5? mg/L 6-BA+0.3? mg/L NAA+莖尖+25 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂）無(wú)論在芽粗、芽高和增殖率都是最高，并且綜合評(píng)價(jià)為優(yōu);這與各因子主效應(yīng)的多重比較結(jié)果一致。第5個(gè)處理A2B2C3D2（MS+1.0? mg/L 6-BA+0.5? mg/L NAA+莖中+25 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂）無(wú)論在芽粗、芽高和增殖率都僅次于處理4，優(yōu)于其他處理，綜合評(píng)價(jià)也為優(yōu)。

3 討論與結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明最佳培養(yǎng)配方為第4個(gè)處理A2B1C2D1（MS+0.5 mg/L 6-BA +0.3 mg/L NAA + 莖尖+25 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂），其次是第5個(gè)處理A2B2C3D2（MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+莖中+25 g/L蔗+7 g/L瓊脂），2個(gè)處理不管是在芽粗、芽高、增殖率和綜合評(píng)價(jià)都是相對(duì)較高的。

其中綜合評(píng)價(jià)為優(yōu)的第5個(gè)處理在配方中外植體選用的部位是莖稍的中部，這一結(jié)果與許多的植物組培[10-14]不一致，可能的原因之一是通關(guān)藤的根、莖、葉中均含有豐富的乳汁，會(huì)造成褐變;其次的原因是通關(guān)藤葉表面密生灰白色的柔毛，在轉(zhuǎn)接

的過程中容易黏附空氣中沒有殺滅的細(xì)菌和病毒而造成污染，這些問題都需要進(jìn)一步的研究。其次配方中培養(yǎng)基選用MS為基本培養(yǎng)基，MS最適宜通關(guān)藤的頂芽與側(cè)芽生長(zhǎng)，無(wú)論在芽粗、芽高、增殖率及芽生長(zhǎng)狀況影響都是最大，1/2MS培養(yǎng)基對(duì)通關(guān)藤頂芽和側(cè)芽的芽粗、芽高和芽的增殖率影響次之，B5培養(yǎng)基對(duì)通關(guān)藤頂芽和側(cè)芽的芽粗、芽高及芽的增殖率影響最小。再次配方中6-BA的濃度在0.5～1.0 mg/L對(duì)通關(guān)藤生長(zhǎng)不管在芽粗、芽高及芽的增殖率方面的影響都是隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，之后又逐漸降低，在1.0 mg/L時(shí)增殖效果最好。配方中NAA對(duì)通關(guān)藤的增殖率和生長(zhǎng)狀況影響作用也是隨著質(zhì)量濃度的增加而增加的，可見NAA在較低質(zhì)量濃度時(shí)對(duì)通關(guān)藤所表現(xiàn)出來(lái)的激素效應(yīng)就很明顯。這一結(jié)果與前一階段進(jìn)行的通關(guān)藤誘導(dǎo)培養(yǎng)相一致[15]。NAA是否一直是隨著濃度的增加而對(duì)通關(guān)藤的生長(zhǎng)呈正相關(guān)值得進(jìn)一步研究。

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析統(tǒng)計(jì)方法作為一種廣泛應(yīng)用的科學(xué)研究方法，在復(fù)雜繁瑣的農(nóng)學(xué)類研究中具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。此次試驗(yàn)所選用的9個(gè)處理在實(shí)際生產(chǎn)中具有較高的代表性，但是基于試驗(yàn)時(shí)間倉(cāng)促，所篩選出的配比方案在實(shí)際生產(chǎn)中可以將植物激素的種類和濃度水平的范圍進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，進(jìn)而選出最優(yōu)最好的培養(yǎng)配方。此外，通關(guān)藤作為一種廣泛分布于熱帶、亞熱帶的植物，除了此次試驗(yàn)中探究的4個(gè)試驗(yàn)設(shè)計(jì)因子外，光周期和晝夜溫差也對(duì)通關(guān)藤的生長(zhǎng)具有重要影響，值得進(jìn)一步的研究。

該試驗(yàn)以云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院組培室培育出的誘導(dǎo)無(wú)菌苗為轉(zhuǎn)接材料，以L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)4個(gè)試驗(yàn)因子，即基本培養(yǎng)基、6-BA、NAA及不同部位轉(zhuǎn)接材料對(duì)增殖苗的芽粗、芽高和增殖率影響的研究，試驗(yàn)設(shè)計(jì)組培苗培養(yǎng)到50 d時(shí)測(cè)量其苗的芽粗、芽高和增殖率并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)4個(gè)試驗(yàn)設(shè)計(jì)因子對(duì)增殖苗的生長(zhǎng)狀況及增殖率均具有極顯著的影響，最終篩選出通關(guān)藤增殖培養(yǎng)的最優(yōu)配方為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+莖尖+25 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂。

參考文獻(xiàn)

[1] 中國(guó)科學(xué)院《中國(guó)植物志》編輯委員會(huì).中國(guó)植物志：第63卷[M].北京：科學(xué)出版社，2004：463.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].北京：人民衛(wèi)生出版社，1977：243-249.

[3] 冷彩云，張慧，喬佳，等.通關(guān)藤及其混淆品的鑒別研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2014，25（4）： 874-875.

[4] 張全昌，張慧，康廷國(guó).中藥烏骨藤化學(xué)成分及質(zhì)量控制研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2014，32（4）：751-753.

[5] 張貴君.現(xiàn)代中藥材商品通鑒[M].北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2001：1200.

[6] 羅思齊，徐光漪，易大年，等.通關(guān)藤中一個(gè)新C21甾族化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)測(cè)定[J].化學(xué)學(xué)報(bào)，2013，44（4）：321-324.

[7] SINGHAL S，KHARE M P，KHARE A.Cissogenie，a pregnane genin from Marsdenia tenacisiima[J].Phytochemistry，1980，19（11）：2427-2430.

[8] 肖雪峰，劉麗，郭巧生，等.通關(guān)藤種子萌發(fā)條件的研究[J].中草藥，2015，46（5）：746-748.

[9] 孟衡玲，楊生超，張薇，等.不同基質(zhì)和激素對(duì)通關(guān)藤扦插生根的影響[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2014，29（4）：540-543.

[10] 馮亦平，張利平，王巖花，等.金線蓮?fù)庵搀w的篩選及不定芽誘導(dǎo)的研究[J]. 種子，2009，28（10）：19-22.

[11] 祁永瓊，王麗莉，羅瑞芳，等.金線蓮不同外植體組織培養(yǎng)成苗技術(shù)探討[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（8）：57-59.

[12] 張衛(wèi)芳，高疆生，歐勇慧，等.抑制核桃組培中的褐化現(xiàn)象初探[J].落葉果樹，2003，35（3）：4-7.

[13] 梅興國(guó)，董妍玲，潘學(xué)武.紅豆杉細(xì)胞繼代培養(yǎng)防褐變措施的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2001，13（4）：8-11.

[14] 羅虹，陳汝民.墨蘭的組織培養(yǎng)和快速繁殖[J].植物生理學(xué)通訊，1997，33（6）：436-437.

[15] 韓俊，楊生超，王自林，等.SAS正交設(shè)計(jì)篩選通關(guān)藤組培誘導(dǎo)培養(yǎng)基的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（17）：98-99.149.