康爭春 鄂繼福 朱良亮 閆飛虎 于恩達(dá)

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是我國最常見的胃腸道惡性腫瘤之一，雖然目前建立起了包括根治性手術(shù)切除、放療、化療、分子靶向治療等綜合治療方法體系，但是部分患者仍然出現(xiàn)治療后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，最終導(dǎo)致死亡的情況［1］。結(jié)直腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是一個包含了多階段、多基因、多因素的極其復(fù)雜的過程，其從原發(fā)灶脫離、遷移、種植、生長、增殖，形成轉(zhuǎn)移灶，受到多種基因及信號通路的調(diào)控［2］。目前在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中，體細(xì)胞突變發(fā)揮著尤為重要的作用已經(jīng)成為腸癌科研工作者的共識［3-4］。隨著研究的深入，人們認(rèn)識到，體細(xì)胞突變不僅可以在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中產(chǎn)生重要影響，而且還對腫瘤的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散發(fā)揮不可忽視的作用［5-6］。因此，探索結(jié)直腸原發(fā)性癌灶與結(jié)直腸轉(zhuǎn)移性癌灶的分子差異，尋找其中的關(guān)鍵的體細(xì)胞突變，進(jìn)而加深加強(qiáng)對結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的分子調(diào)控機(jī)制的理解，對于預(yù)測發(fā)生轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的標(biāo)志物，或者可能將其關(guān)鍵分子研發(fā)為新的治療靶點，具有重要意義。本研究利用來自癌癥體細(xì)胞突變目錄（catalogue of somatic mutations in cancer，COSMIC）的全外顯子測序數(shù)據(jù)，確定了結(jié)直腸原發(fā)癌灶組織和結(jié)直腸轉(zhuǎn)移性癌灶組織之間顯著差異的體細(xì)胞基因突變，并進(jìn)行功能富集分析，分析了差異基因突變富集的功能和通路。

資料與方法

一、患者和組織樣本數(shù)據(jù)的下載及預(yù)處理

首先，從癌癥體細(xì)胞突變目錄官方網(wǎng)站（COSMIC，https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/）下載COSMIC Mutation Data，其中包含兩類組織樣本，一類組織樣本包含全外顯子測序數(shù)據(jù)，另一類組織樣本包含目標(biāo)基因測序數(shù)據(jù)。從中提取結(jié)直腸原發(fā)性癌及結(jié)直腸轉(zhuǎn)移性癌全外顯子測序數(shù)據(jù)。然后，下載COSMIC Sample Features數(shù)據(jù)，其中包含網(wǎng)站收集樣本的基本信息及臨床病理數(shù)據(jù)。從中提取結(jié)直腸原發(fā)性癌及結(jié)直腸轉(zhuǎn)移性癌全外顯子測序的組織樣本的基本信息及臨床病理數(shù)據(jù)。

二、計算并統(tǒng)計結(jié)直腸癌基因位點突變率

利用perl 5.28.0對上述抽提的含有全外顯子測序的結(jié)直腸癌組織樣本的基因突變位點進(jìn)行統(tǒng)計，分別記錄COSMIC ID、突變位點及類型、突變基因、突變組織樣本總數(shù)、突變樣本占總樣本比率。并分析高突變率的基因位點。

三、篩選結(jié)直腸原發(fā)性癌和結(jié)直腸轉(zhuǎn)移性癌差異突變基因

利用perl 5.28.0整理并統(tǒng)計全外顯子測序數(shù)據(jù)中19 055個基因突變情況，記錄基因在結(jié)直腸原發(fā)性癌和結(jié)直腸轉(zhuǎn)移性癌的突變型數(shù)目和野生型數(shù)目，并在R3.5.0環(huán)境下，對每個基因突變分布情況行卡方檢驗或Fisher確切概率法計算其差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。

四、篩選結(jié)直腸原發(fā)性癌和結(jié)直腸轉(zhuǎn)移性癌差異突變基因位點

利用perl 5.28.0整理并統(tǒng)計全外顯子測序數(shù)據(jù)中174 413個基因突變位點情況，記錄基因位點在結(jié)直腸原發(fā)性癌和結(jié)直腸轉(zhuǎn)移性癌的突變型數(shù)目和野生型數(shù)目，并在R3.5.0環(huán)境下，對每個基因位點突變分布情況行卡方檢驗或Fisher確切概率法計算其差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義，并在manhattan圖中實現(xiàn)可視化。

五、差異突變基因的功能通路富集分析

將具有統(tǒng)計學(xué)意義的顯著性差異突變基因通過 DAVID Bioinformatics Resources（https://david.ncifcrf.gov/version 6.8）做GO富集分析，通過KOBAS3.0（http://kobas.cbi.pku.edu.cn/）做 KEGG通路富集分析。高度富集的GO功能或KEGG通路被認(rèn)為是差異突變基因的潛在功能。

結(jié) 果

一、組織樣本的一般情況

共有2 333例結(jié)直腸癌組織樣本納入研究，均含有全外顯子測序數(shù)據(jù)。其中包含699例結(jié)直腸原發(fā)性癌組織樣本，58例結(jié)直腸轉(zhuǎn)移性癌組織樣本，21例局部復(fù)發(fā)結(jié)直腸癌組織樣本，1 555例未知類型結(jié)直腸癌組織樣本。其中58例結(jié)直腸轉(zhuǎn)移性癌組織樣本中轉(zhuǎn)移部位為肝臟有22例，肺有3例，腹水2例，腹壁2例，淋巴結(jié)1例，卵巢1例，骨盆1例，胃1例，信息缺失25例。

二、結(jié)直腸癌基因位點突變率一般情況

共發(fā)現(xiàn)692 684個基因突變位點，基因位點突變率前30的位點分別為COSM476、COSM521、C O S M 5 3 2、CO S M 5 2 0、C OS M 10 6 4 8、COSM252949、COSM763、COSM270052、COSM13127、COSM18852、COSM1180896、COSM2851820、COSM179404、COSM927946、COSM1384188、COSM10659、COSM10660、C O S M 77 5、C O S M7 6 0、C OS M 1 0 7 0 4、COSM329668、COSM516、COSM19695、COSM1458728、COSM269905、COSM10656、COSM13134、COSM1440465、COSM10662、COSM19404等，如表1所示。

表1 突變率top30的基因位點

三、結(jié)直腸原發(fā)性癌和結(jié)直腸轉(zhuǎn)移性癌差異突變基因結(jié)果

共發(fā)現(xiàn)120個基因突變差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），分別為 RHEB、RP11-368J21.2、AGAP10、PRKRIR、NMRAL1、QPCT、TOMM40、PYCR2、SLC18A1、KDR等。 其 中top30基因突變?nèi)绫?所示。

四、結(jié)直腸原發(fā)性癌和結(jié)直腸轉(zhuǎn)移性癌差異突變基因位點結(jié)果

共發(fā)現(xiàn)328個基因突變位點差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），分別為R H E B|C O S M 5 7 5 7 0 1 2|c.1 6 9 C ＞ T、A O C 3|C O S M 5 7 5 5 0 4 5|c.1 6 3 4 T ＞ C、N M R A L 1|C O S M 1 4 8 0 11|c.7 5 5 C＞ T、I P M K|C O S M 5 7 5 3 5 0 9|c.1 0 9 6 T ＞ G、E S C O 2|C O S M 1 5 0 4 7 7|c.2 3 9 C ＞ T、T R P V 2|C O S M 1 4 8 2 0 0|c.5 0 G ＞ C、U2SURP|COSM5756177|c.769G＞ C、G C O M 1|C O S M 1 4 7 9 2 6|c.8 3 0 C ＞ T、A G A P 1 0|C O S M 4 1 5 0 1 9|c.6 8 3 A＞ G、SACM1L|COSM149368|c.1301A＞T等。其中top30基因突變位點如表3所示。如圖1所示，我們可以很容易發(fā)現(xiàn)全部差異基因突變位點的染色體位置及差異的P值，紅線代表P值等于0.05。

五、功能通路富集分析結(jié)果

為了了解差異突變基因在結(jié)直腸癌生物學(xué)中的作用，我們通過功能通路富集分析對差異突變基因功能進(jìn)行了富集分析。通過對差異突變基因篩選結(jié)果，對差異突變基因進(jìn)行GO和KEGG功能通路富集分析，推斷差異突變基因潛在的生物學(xué)過程。我們發(fā)現(xiàn)這些差異突變基因在大量的脫氫酶活性功能如D-阿拉伯糖醇脫氫酶活性、異檸檬酸脫氫酶活性、類固醇脫氫酶活性、乙偶姻脫氫酶活性、葡萄糖酸脫氫酶活性等富集，一些重要的還原酶類，如D苯基香豆素芐基醚還原酶活性富集，細(xì)胞周期相關(guān)功能如細(xì)胞周期停滯，細(xì)胞基本生命活動如O-聚糖加工、銅離子結(jié)合、G蛋白偶聯(lián)受體活性、D-核酮糖形成（NADP＋）活性等富集差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，如圖2所示。通路富集層面，通過KOBAS3.0的KEGG通路富集分析，我們發(fā)現(xiàn)在下列通路中差異突變基因有富集：代謝途徑、PI3K-Akt信號通路、細(xì)胞周期、細(xì)胞粘附分子、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、細(xì)胞色素P450對異生素的代謝、鉑類耐藥性、粘著力、ECM-受體相互作用、真核生物中的核糖體發(fā)生、壽命調(diào)節(jié)通路、苯丙氨酸代謝、原發(fā)性膽汁酸生物合成等，如圖3所示。

討 論

結(jié)直腸癌作為最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤對我國人民生命健康造成了嚴(yán)重威脅，并且近年來發(fā)病率呈現(xiàn)上升的趨勢。盡管目前針對結(jié)直腸癌的治療手段日趨完善，更加多樣化、立體化，但是由于結(jié)直腸癌是一種分子水平異質(zhì)性很大的癌癥，其難以預(yù)測的復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍然是醫(yī)務(wù)工作者和腫瘤科研工作者面臨的嚴(yán)峻難題?！绑w細(xì)胞突變學(xué)說”在腫瘤發(fā)生機(jī)制中發(fā)揮重要作用目前在很大一部分學(xué)者中形成共識，然而近年來，人們發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞突變在腫瘤的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散中也有著很大的推動作用。因此，挖掘結(jié)直腸原發(fā)性癌灶與結(jié)直腸轉(zhuǎn)移性癌灶的關(guān)鍵體細(xì)胞突變，深入理解結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的調(diào)控機(jī)制，對于今后結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移生物標(biāo)志物甚至結(jié)直腸轉(zhuǎn)移性癌的治療靶點的選擇具有十分重要的意義。

越來越多的學(xué)者證明體細(xì)胞突變直接影響著結(jié)直腸癌是否發(fā)生轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)移途徑、轉(zhuǎn)移方式，乃至轉(zhuǎn)移的靶器官。BRAF基因突變型的結(jié)直腸癌患者發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的概率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其野生型患者［7］，KRAS基因突變型的結(jié)直腸癌患者則更容易發(fā)生肺臟轉(zhuǎn)移［8］，甚至是甲狀腺轉(zhuǎn)移［9］，腦轉(zhuǎn)移在KRAS基因突變型合并PIK3CA基因突變型的結(jié)直腸癌患者中出現(xiàn)機(jī)會也更大［10］。然而目前對結(jié)直腸癌整體的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因突變的認(rèn)識尚未形成，因此要更全面的挖掘、篩選并整合結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)體細(xì)胞突變基因。

表3 結(jié)直腸原發(fā)性癌和結(jié)直腸轉(zhuǎn)移性癌top30差異突變基因位點結(jié)果

COSMIC［11］數(shù)據(jù)庫是目前關(guān)于癌癥體細(xì)胞突變的最大、最全的數(shù)據(jù)庫，它主要記錄體細(xì)胞突變、突變位點的信息，另外其記錄內(nèi)容十分詳細(xì)，包括組織類型、組織樣品名稱等等，涉及到不同基因、不同腫瘤或細(xì)胞系的突變信息。全外顯子測序［12］是指通過序列捕獲技術(shù)將全基因組外顯子區(qū)域的脫氧核苷酸堿基序列捕獲并進(jìn)行高通量測序的一種測序技術(shù)，其測序精度高，有利于低頻率突變的檢出并且價格相對低廉，目前廣泛應(yīng)用于體細(xì)胞突變檢測領(lǐng)域。本研究主要借助COSMIC公共數(shù)據(jù)庫，對COSMIC數(shù)據(jù)庫記錄的結(jié)直腸癌患者組織樣本全外顯子測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析研究，篩選出了如 RHEB、RP11-368J21.2、AGAP10、PRKRIR 等120個在結(jié)直腸原發(fā)性癌灶和結(jié)直腸轉(zhuǎn)移性癌灶之間的顯著性差異突變基因，進(jìn)一步對其突變位點分析，共發(fā)現(xiàn)RHEB|COSM5757012|c.169C＞T、A O C 3|C O S M 5 7 5 5 0 4 5|c.1 6 3 4 T ＞ C、NMRAL1|COSM148011|c.755C＞T等328個基因突變位點差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，并進(jìn)一步在manhattan圖中對突變位點進(jìn)行了可視化。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，部分基因突變在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中的重要作用已經(jīng)得到學(xué)者證實，如SLC18A1［13］、KDR［14］、ANAPC1［15］等，但大部分突變基因和突變位點并未發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究。對120個具有顯著差異的突變基因進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，揭示了差異體細(xì)胞突變基因的潛在功能，如脫氫酶活性、還原酶活性、細(xì)胞周期停滯、O-聚糖加工、銅離子結(jié)合等富集差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。通路富集層面，代謝途徑、PI3K-Akt信號通路、細(xì)胞周期、細(xì)胞粘附分子、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、鉑類耐藥性、ECM-受體相互作用、苯丙氨酸代謝、原發(fā)性膽汁酸生物合成等重要通路都有差異突變基因的富集。分析其內(nèi)在原因可能由于結(jié)直腸轉(zhuǎn)移性癌的組織標(biāo)本中有相當(dāng)一部分腸癌肝臟轉(zhuǎn)移灶造成。顯示了本研究的可靠性及對今后結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移機(jī)制研究的參考價值。

綜上所述，我們利用COSMIC數(shù)據(jù)庫挖掘結(jié)直腸原發(fā)癌灶與轉(zhuǎn)移癌灶之間的具有統(tǒng)計學(xué)差異的體細(xì)胞突變基因并進(jìn)行功能分析，這些發(fā)現(xiàn)有助于幫助我們深入理解結(jié)直腸癌在轉(zhuǎn)移過程中的體細(xì)胞突變基本情況，并為將來的機(jī)制研究提供參考，并有可能作為診斷結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物和轉(zhuǎn)移的治療靶點應(yīng)用于臨床。

圖1 差異基因突變位點的manhattan圖（橫坐標(biāo)代表染色體位置，縱坐標(biāo)代表-log10 p，紅線代表P值等于0.05）

圖2 GO功能富集結(jié)果

圖3 KEGG通路富集結(jié)果