臧佳 謝亞運 李新星 張言言 胡志前

絕大多數(shù)惡性腫瘤生長迅速，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)部處于相對缺血、缺氧的狀態(tài)。在缺氧的條件下，缺氧誘導(dǎo)因子 1α（hipoxia induce factor 1α，HIF1α）亞基因降解受到抑制而在腫瘤細(xì)胞內(nèi)部堆積［1-2］。大量堆積的HIF1α廣泛啟動下游基因的表達(dá)，改變細(xì)胞的能量代謝方式，誘導(dǎo)毛細(xì)血管生成，加速腫瘤細(xì)胞分裂、增殖［3-4］。

以往研究認(rèn)為B-淋巴細(xì)胞瘤蛋白9（B-cell lymphoma 9，BCL9）是Wnt通路下游的轉(zhuǎn)錄協(xié)同因子，BCL9的表達(dá)能促進(jìn)肝癌，胃癌，乳腺癌的發(fā)展［5-7］。在BCL9的啟動區(qū)域，存在多個缺氧誘導(dǎo)反應(yīng)元件（hipoxia response element，HRE），BCL9可能受到HIF1α調(diào)控表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。目前，BCL9在結(jié)腸癌中的研究尚未見詳細(xì)報道，本研究擬探索HIF1α對BCL9的調(diào)控關(guān)系，并進(jìn)一步探明BCL9對結(jié)腸癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)作用。

材料與方法

一、一般資料

本研究中所有結(jié)腸癌標(biāo)本及同一患者的正常結(jié)腸標(biāo)本，皆來自2013年1月至2016年7月在上海長征醫(yī)院接受了腫瘤切除手術(shù)的患者，并且術(shù)后病理確診為結(jié)腸癌。所入選的病例均被告知研究內(nèi)容，并取得患者本人或委托人的知情同意。收取的典型結(jié)腸癌及相應(yīng)正常結(jié)腸組織立即放入液氮凍存或福爾馬林固定。本研究中所使用的HCT116細(xì)胞購自美國ATCC公司，配制含10%胎牛血清、90%DMEM高糖培養(yǎng)基、1%雙抗（鏈霉素、青霉素）的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，低氧培養(yǎng)時設(shè)置氧濃度為4%。

二、實驗方法

1.免疫組織化學(xué)檢測BCL9：10%福爾馬林固定標(biāo)本；梯度乙醇脫水，石蠟包埋組織；切片機切片（4 μm）；60度烘烤切片20 min，二甲苯浸泡10 min（2次），無水乙醇浸泡5 min，梯度乙醇脫水，蒸餾水洗滌；使用抗原修復(fù)液修復(fù)抗原，3%雙氧水阻斷過氧化物；BCL9（1:3 000稀釋；ab37305，Abcam），室溫孵育1 h，PBS洗滌5 min，3次；孵育二抗，過程同前；使用DAB溶液顯色7 min；蘇木精復(fù)染，松節(jié)油封片，晾干；顯微鏡鏡下觀察、拍照。

2. RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及實時定量PCR：按常規(guī)方法抽提總RNA，使用TAKARA公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄。熒光實時定量PCR試劑購自Biotool公司，依說明書配制反應(yīng)體系。設(shè)置反應(yīng)程序為：初始95℃ 10 min；95 ℃ 30 s解鏈，58℃ 30 s退火，72℃ 10 s延伸，共40個循環(huán)；以GAPDH為內(nèi)參，設(shè)三個復(fù)孔，取平均值。BCL9引物為，正向：5′-CAGCTGGATTCCAAATTCTC-3′， 反 向：5′-GAGTCGGCGGAAATACTTCG-3′；GAPDH 引物為，正向：5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′，反向：5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′。

3. 蛋白印記法檢測BCL9、HIF1α表達(dá)：裂解細(xì)胞收集蛋白；常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜；10%脫脂牛奶封閉，室溫、搖床約2 h；TBST漂洗5 min；將PVDF膜放入抗體孵育盒中，加入用一抗體稀釋液（抗 BCL9、HIF1α、Actin，購自美國Santa公司），搖床4℃過夜；搖床上用TBST緩沖液漂洗3次，每次10 min；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（美國Santa），搖床室溫孵育1 h；TBST漂洗3次，將ECL發(fā)光底物A、B按比例混合，適量覆蓋PVDF膜，顯影。

4. 熒光素酶活性檢測：設(shè)計引物調(diào)取BCL9的啟動子序列，5′-ACG CGT GCT AGC CCG GGC AGA TGG TCT CCG TCT CCT-3′；5′-AAC AGT ACC GGA ATG CCA GAC AAG CCA CAA ACA AGA C-3′；將啟動子序列克隆至PGL3載體XhoIHindIII酶切位點之間，測序驗證載體構(gòu)建成功（PGL3-P-BCL9）；實驗組轉(zhuǎn)染PGL3-P-BCL9后予缺氧處理或合并轉(zhuǎn)染HIF1α表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1＋HIF1α，購自金維智公司），對照組轉(zhuǎn)染PGL3-P-BCL9后予常氧培養(yǎng)或合并轉(zhuǎn)染pcDNA3.1＋，48 h后裂解細(xì)胞，加熒光素試劑（購自Biotool公司），檢測熒光值。

5. CCK8細(xì)胞活性及Transwell實驗：以HCT116為靶細(xì)胞，轉(zhuǎn)染siRNA或過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1＋BCL9干 預(yù)BCL9的 表 達(dá)（siRNA序 列 為：CCUGAGGAGAUGCUGAAAUUAC），通過實時熒光定量PCR檢測干預(yù)效率，將干預(yù)后的HCT116細(xì)胞以相同密度接種于96孔板中，于36 h檢測吸光度；將干預(yù)后的HCT116細(xì)胞以相同密度接種于Transwell上室（武漢博士德生物技術(shù)有限公司），下室加入含10% FBS的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后結(jié)晶紫染色，拍照記錄結(jié)果。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、結(jié)腸癌中BCL9表達(dá)升高

通過免疫組化技術(shù)，檢測20例結(jié)腸癌及同一患者正常結(jié)腸組織中BCL9的表達(dá)。結(jié)果如圖1A所示，腫瘤組織中BCL9表達(dá)量明顯高于正常組織。圖1B為實時熒光定量PCR檢測腫瘤及正常組織中BCL9 RNA的表達(dá)量，腫瘤組織中BCL9 RNA的表達(dá)量明顯高于瘤旁組織［（3.25±0.53）vs.（1.03±0.12），P＜0.05］，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 腫瘤組織與正常組織的免疫組化與實時熒光定量PCR。1A：免疫組織化療結(jié)果顯示，腫瘤組織的BCL9表達(dá)量明顯高于正常組織（10倍鏡與40倍鏡下）；1B：實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)BCL9 RNA的表達(dá)明顯高于正常組織，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義

二、結(jié)腸癌中HIF1α調(diào)控BCL9表達(dá)

在BCL9啟動區(qū)域存在3個HRE，其具體位置如圖2A所示，HRE是HIF1α識別并結(jié)合靶基因的位點。通過缺氧或常氧培養(yǎng)HCT116細(xì)胞，于36 h后抽提總RNA進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測，結(jié)果如圖2B，缺氧與常氧組比較，［（6.71±0.83）vs.（1.54±0.21），P ＜ 0.05］，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；同時，我們抽提靶細(xì)胞蛋白，通過western-blot在蛋白水平驗證BCL9的表達(dá)（圖2C）。通過上述結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)BCL9表達(dá)升高。為了進(jìn)一步驗證缺氧誘導(dǎo)BCL9表達(dá)是通過HIF1α所介導(dǎo)，我們構(gòu)建了含BCL9啟動子區(qū)域的熒光素酶報告載體PGL3-P-BCL9，并進(jìn)行熒光素酶報告實驗，結(jié)果顯示如圖2D-E所示，缺氧或過表達(dá)HIF1α后熒光素酶活性明顯增強［（3.53±0.75）vs.（0.96±0.15），（4.83±0.62）vs.（1.02±0.14）；P＜0.05］。上述結(jié)果表明，缺氧誘導(dǎo)HIF1α激活BCL9的表達(dá)。

圖2 HIF1α調(diào)控BCL9表達(dá)。2A：BCL9啟動子區(qū)缺氧誘導(dǎo)原件（HER）的分布；2B：實時熒光定量PCR檢測BCL9 RNA的表達(dá)；2C：western-blot檢測BCL9、HIF1α的表達(dá)；2D、2E：熒光素酶活性檢測。代表P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義

三、BCL9促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移

以HCT116為靶細(xì)胞，通過siRNA或過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1＋BCL9干預(yù)BCL9的表達(dá)，實時熒光定量PCR檢測干預(yù)效率，結(jié)果如圖3A所示。干擾BCL9表達(dá)后，HCT116細(xì)胞的增殖活性明顯受到抑制［（1.23±0.12）vs.（1.87±0.15），P＜0.05］；過表達(dá)BCL9后，HCT116細(xì)胞的增殖活性明顯增強［（2.43±0.16）vs.（1.81±0.14），P＜0.05］，結(jié)果如圖3B所示。同時，干擾BCL9表達(dá)后，HCT116細(xì)胞的遷移能力明顯受到抑制；而過表達(dá)BCL9促進(jìn)了HCT116細(xì)胞遷移（圖3C～D）。

圖3 BCL9對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響。3A：實時熒光定量PCR檢測BCL9干預(yù)效率；3B：CCK8實驗檢測干預(yù)BCL9后HCT116的增殖活性；3C、3D：Transwell實驗檢測干預(yù)BCL9后HCT116的增殖活性。代表P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義

討 論

結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率占胃腸道腫瘤的第三位，其發(fā)病年齡基本在40歲以上，高發(fā)于50～60歲之間，男女比例為2～3:1。近年來，結(jié)腸癌的發(fā)病率與病死率呈上升趨勢，全世界每年大約有120萬新增病例。盡管近年來外科手術(shù)和化療方面取得了長足的進(jìn)展，患者的5年生存率至今仍徘徊在50%左右，多數(shù)患者最終仍然死于結(jié)腸癌的局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［8］。了解結(jié)腸癌惡性生物學(xué)行為的分子機制，探索精準(zhǔn)、有效的治療方法已成為國內(nèi)外研究該疾病的焦點。

人源BCL9首先在B細(xì)胞急性淋巴母細(xì)胞白血?。ˋLL）患者中發(fā)現(xiàn)，屬于條件細(xì)胞核相關(guān)蛋白并可穿梭于細(xì)胞核內(nèi)外，在與核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄輔因子Pygo結(jié)合后則分布于核內(nèi)［9］。有研究表明，BCL9在Wnt信號通路中作為銜接蛋白與β-catenin、TCF/LEF和Pygopus結(jié)合，形成TCF/LEF-βcatenin-BCL9-PYGO四聚體核復(fù)合物，從而參與激活經(jīng)典Wnt信號通路下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移以及腫瘤組織血管生成［10-11］。BCL-9在多中惡性腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，如多發(fā)性骨髓瘤、肝細(xì)胞癌、胃癌、乳腺癌及肺腺癌組織等表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖［5-7］。關(guān)于BCL9在結(jié)腸癌中的研究尚未見到詳細(xì)報道，我們通過免疫組化及實時熒光定量PCR檢測20例結(jié)腸癌組織及相應(yīng)的正常結(jié)腸組織，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌中BCL9表達(dá)明顯增高。

由于惡性腫瘤生長迅速，腫瘤內(nèi)部微環(huán)境常處于相對缺氧的狀態(tài)，造成HIF1α在細(xì)胞內(nèi)堆積，并與HIF1β形成穩(wěn)定的二聚體進(jìn)入細(xì)胞核，激活大量下游基因的表達(dá)，調(diào)整細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境［12-13］。HIF1α特異性地識別并結(jié)合HRE（G/ACGTG），從而激活靶基因的轉(zhuǎn)錄［14］，在BCL-9啟動子區(qū)域存在多個HRE，我們認(rèn)為結(jié)腸癌中BCL9的高表達(dá)可能由HIF1α激活所致。我們以HCT116細(xì)胞為靶細(xì)胞，給予缺氧處理后發(fā)現(xiàn)BCL9及HIF1α的表達(dá)在RNA水平及蛋白水平中顯著提高。為了進(jìn)一步驗證HIF1α對BCL9的調(diào)控關(guān)系，我們構(gòu)建了含有BCL9啟動子序列的熒光素酶報告載體，通過合并轉(zhuǎn)染對照和過表達(dá)HIF1α質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HIF1α后熒光素酶活性明顯增強，這進(jìn)一步證明了HIF1α對BCL9的調(diào)控關(guān)系。隨后，為了探索異常表達(dá)的BCL9對結(jié)腸癌的生物學(xué)作用，我們通過siRNA和過表達(dá)質(zhì)粒干預(yù)HCT116細(xì)胞中BCL9的表達(dá)，結(jié)果表明干擾BCL9的表達(dá)可以抑制HCT116細(xì)胞的增殖及遷移能力，增強BCL9的表達(dá)可以促進(jìn)HCT116細(xì)胞的增殖及遷移能力。

本研究表明，缺氧誘導(dǎo)BCL9在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，并且BCL9高表達(dá)可以促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖及遷移，為研究結(jié)腸癌惡性生物學(xué)行為的分子機制提供了新的理論借鑒。同時，由于BCL9又是Wnt信號通路上的重要的轉(zhuǎn)錄協(xié)同因子，這表明缺氧信號通路可能通過BCL9參與Wnt信號通路的調(diào)控，為信號通路的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系研究提供新的思路。