方翟 范文斌 高慶華

摘要：綿羊的雙肌臀（Callipyge）基因表現(xiàn)型為后臀肌肉增大近30%，由位于綿羊第18號(hào)常染色體上基因上游存在一個(gè)N→ C的單核苷酸多態(tài)性（SNP）標(biāo)記（命名為SNPCLPG）產(chǎn)生的，該SNP標(biāo)記的存在與Callipyge表現(xiàn)完全吻合。為此，根據(jù)已知多態(tài)性，選擇設(shè)計(jì)合成了1對(duì)引物，以多浪羊?yàn)檠芯繉?duì)象，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序，進(jìn)行了SNPCLPG位點(diǎn)的檢測(cè)。獲得303 bp的擴(kuò)增片斷，測(cè)序后進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)在38 bp處堿基產(chǎn)生A到G的突變，在80、92、149、219 bp處堿基產(chǎn)生T到C的突變。

關(guān)鍵詞：多浪羊;PCR;雙肌臀;突變

中圖分類號(hào)：S826 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：1007-273X（2019）07-0005-03

多浪羊是新疆特有的一個(gè)優(yōu)良的肉脂兼用型綿羊品種，因其中心產(chǎn)區(qū)在麥蓋提縣，故又稱麥蓋提羊。多浪羊體格大、產(chǎn)肉多、肉質(zhì)鮮嫩、性成熟早、繁殖率高、遺傳性能穩(wěn)定。大部分母羊可達(dá)到兩年三產(chǎn)，雙羔率達(dá)30%～40%，4～5月齡羔羊體重可達(dá)35 kg;育肥性能好，育肥羊屠宰率可達(dá)55%以上，是組織羔羊肉生產(chǎn)的理想品種。

在綿羊的品種改良中，培育產(chǎn)肉量高、肉質(zhì)好、嫩度高的綿羊品種一直是育種工作者不懈的追求，通過(guò)傳統(tǒng)的遺傳改良和營(yíng)養(yǎng)調(diào)控手段來(lái)提高動(dòng)物的瘦肉率和肌肉品質(zhì)已很難再有大的進(jìn)展。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展和動(dòng)物基因組研究的深入開(kāi)展，加快了對(duì)綿羊雙?。–allipyge）性狀更進(jìn)一步的研究。

研究發(fā)現(xiàn)該性狀是由于18號(hào)常染色體上的一個(gè)野生型等位基因（N）發(fā)生突變所致，而且該突變基因以非孟德?tīng)柗绞竭z傳[1]。目前試驗(yàn)已證實(shí)了Callipyge突變基因以極性超顯性的方式遺傳。一般用C（代表突變基因Callipyge）、N（代表正常野生型基因）控制雙肌性狀的這一對(duì)等位基因，組成4種基因型（CC、CN、NC和NN），但僅有從父本中獲得CN基因型的雜合子公羊才表現(xiàn)出雙肌臀性狀，其他3種基因型個(gè)體都表現(xiàn)正常。

Callipyge 的遺傳效應(yīng)在肉用型、毛用型和多胎型等得到了廣泛的研究，其中最顯著的就是提高雙肌臀羊的瘦肉率這一遺傳效應(yīng)，Callipyge基因使雙肌臀羊腰部和腿部的肌肉過(guò)度發(fā)育而顯著增大;同時(shí)，該基因還能使皮下、肌間、肌內(nèi)和腎臟周圍的脂肪減少，進(jìn)而間接地增加了綿羊的瘦肉率。Freking等[2]的研究都證明了這一觀點(diǎn)，這和動(dòng)物生產(chǎn)者的經(jīng)濟(jì)利益相關(guān)性最強(qiáng)。此外，Callipyge基因還對(duì)屠宰率、飼料利用率、胴體性狀等產(chǎn)生一定的影響。

本研究采集多浪羊血液樣本，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增CalliPyge基因，旨在驗(yàn)證多浪羊Callipyge基因是否存在突變。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?樣品 ?在塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)站隨機(jī)選取23只多浪羊母羊，用10 mL的真空采血管（檸檬酸鈉抗凝）頸靜脈采血5 mL，放置在冰盒內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 ?PCR引物設(shè)計(jì) ?CalliPyge基因引物參照Freking[2]等在GenBank中發(fā)表的包括CLPGSNP位點(diǎn)的DNA序列（登錄號(hào)：AF401294）設(shè)計(jì)引物，長(zhǎng)度為303 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物Calli-F：5′-CAGCAGCAGAGCAG

AGAAC-3′;下游引物Calli-R：5′-AAATTGGAAGGC

TTGGAGGT-3′。

1.1.3 ?主要試劑 ?血液基因組DNA提取試劑盒（TIANamp Blood DNA Kit、離心柱型）（購(gòu)自天根生化科技有限公司）、超純水、EB、Marker，Buffer、5倍TAE（Tris 12.1 g、EDTA 1.86 g、醋酸2.855 mL，蒸餾水加至500 mL）。

1.1.4 ?主要儀器與設(shè)備 ?主要儀器與設(shè)備名稱見(jiàn)表1。

1.2 ?方法

PCR擴(kuò)增體系見(jiàn)表2。按照預(yù)試驗(yàn)所得最適退火溫度為57 ℃， PCR反應(yīng)優(yōu)化條件為：94 ℃預(yù)變性4 min→94 ℃ 變性30 s→57 ℃ 退火30 s→72 ℃ 延伸1 min→72 ℃延伸10 min→于4 ℃保存，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

將檢驗(yàn)合格的PCR產(chǎn)物編號(hào)，放置于有冰袋的泡沫箱中，密封，寄送到生工生物工程（上海）股份有限公司，雙通測(cè)序。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?DNA提取結(jié)果

利用試劑盒提取多浪羊血液DNA，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物條帶單一，是所需要的目的條帶（圖1）。

2.2 ?PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)Callipyge基因的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物條帶單一，大小稍大于300 bp，與目的片段長(zhǎng)度303 bp大小一致（圖2）。

2.3 ?測(cè)序結(jié)果

2.3.1 ?直接測(cè)序結(jié)果 ?生工生物工程（上海）股份有限公司的測(cè)序結(jié)果為303 bp，與目的片段長(zhǎng)度303 bp符合。利用Chromas軟件將測(cè)序結(jié)果導(dǎo)出，其中部分測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.3.2 ?堿基數(shù)目分析 ?通過(guò)對(duì)23個(gè)樣品進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，堿基A占28.12%，堿基T占29.85%，堿基C占24.54%，堿基G占17.49%。其中C+G含量占42.03%，A+T含量占57.97%，A+T含量遠(yuǎn)高于C+G的含量。

2.3.3 ?突變分析 ?用NDAMAN分析，Identity=99.79%，在38 bp處堿基A突變?yōu)镚，在80、92、149、219 bp處堿基T突變?yōu)镃（圖4）。

3 ?討論

多浪羊個(gè)體大、生長(zhǎng)發(fā)育快、早熟性好，有寶貴的多胎性和繁殖率高、采食能力強(qiáng)、飼料報(bào)酬高、產(chǎn)肉性能好、肉質(zhì)鮮美可口、被毛絨毛多、毛質(zhì)較好、性情溫順、遺傳性穩(wěn)定等特點(diǎn)，廣受養(yǎng)殖戶的喜愛(ài)。Callipyge基因可有效提高綿羊的瘦肉率、屠宰率和飼料利用率等性能。本研究檢測(cè)了雙肌臀基因在多浪羊上的表達(dá)，尋找其突變位點(diǎn)。王海亮等[3]研究發(fā)現(xiàn)第184 bp處C突變?yōu)門，證明可能與山羊雙肌性狀有關(guān)。劉曉敏等[4]對(duì)歐拉型藏羊Callipyge基因多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀相關(guān)性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在176 bp處有N到C的突變。李云龍等[5]對(duì)寧夏回族自治區(qū)賀蘭和鹽池縣分別采集87頭灘羊、73頭特克塞爾羊、70頭薩福克羊和112頭無(wú)角陶賽特羊的血樣研究后發(fā)現(xiàn)，在四個(gè)綿羊品種中沒(méi)有檢測(cè)到?jīng)Q定Callipyge表型的A→G單堿基突變，但在該位點(diǎn)上游35 bp處檢測(cè)到一個(gè)C→T的突變。

4 ?結(jié)論

本研究通過(guò)從多浪羊的血樣中提取DNA，將提取到的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序，測(cè)序后利用DNAstar比對(duì)分析，在38 bp處堿基產(chǎn)生A到G的突變，在80、92、149、219 bp處堿基產(chǎn)生T到C的突變。

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[2] FREKING B A，KEELE J W，BEATTIE C W，et al. Evaluation of the ovine callipyge locus：I. Relative chromosomal position and gene action.[J].Journal of animal science，1998，76（8）：2062-2071.

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