曹丹 壽黎紅 費(fèi)菊萍 方遒 董曉輝 徐寶連 張燕

[摘要] 目的 研究成人慢性免疫性血小板減少癥（Immune Thrombocytopenia，ITP）患者免疫細(xì)胞、免疫因子表達(dá)水平以及二者之間的相關(guān)性。 方法 選取2013年11月～2017年3月期間我院血液科收治的240例ITP患者，根據(jù)ITP國際工作組提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)分為重度ITP患者（重度ITP組）和非重度ITP患者（非重度ITP組），每組各120例。另外選擇同期120例健康體檢人員，作為健康組。分別檢測上述三組Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory cells，Tregs）、Th17/Treg、自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）、樹突狀細(xì)胞（Dendritic cells，DC）等細(xì)胞比例和白介素-2（Interleukin-2，IL-2）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF-α）、γ-干擾素（Interferon-γ，IFN-γ）、免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）等免疫因子表達(dá)水平，分別分析與ITP病情之間以及二者之間的相關(guān)性。 結(jié)果 免疫細(xì)胞Th17、Treg、Th17/Treg和DC比例與患者病情呈顯著相關(guān)性，而Th1、NK細(xì)胞比例與患者病情無顯著相關(guān)性;免疫因子IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ與患者病情呈顯著相關(guān)性，而IgG與患者病情無顯著相關(guān)性。免疫細(xì)胞與免疫因子在ITP中的相關(guān)性分析顯示，Th1細(xì)胞比例與IL-2、IL-6、TNF-α呈顯著正相關(guān);Th17細(xì)胞比例與IL-2、IL-6、IFN-γ呈顯著正相關(guān);Treg細(xì)胞比例與IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ呈顯著負(fù)相關(guān);Th17/Treg細(xì)胞比例與IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ、IgG呈顯著正相關(guān);NK細(xì)胞比例與IL-6、TNF-α、IFN-γ呈顯著正相關(guān);DC比例與IL-2、IL-6、TNF-α呈顯著正相關(guān)。 結(jié)論 細(xì)胞免疫失衡引起機(jī)體免疫因子水平異常，是導(dǎo)致ITP發(fā)生發(fā)展的促進(jìn)因素。

[關(guān)鍵詞] ITP;T細(xì)胞亞群;NK細(xì)胞;樹突狀細(xì)胞亞群;免疫因子

[中圖分類號] R558.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）18-0033-05

[Abstract] Objective To study the expression of immune cells and immune factors in adult patients with chronic immune thrombocytopenia（ITP） and the correlation between them. Methods A total of 240 ITP patients admitted to our Department of Hematology from November 2013 to March 2017 were enrolled. According to the diagnostic criteria proposed by the ITP International Working Group， they were divided into severe ITP patients（severe ITP group） and non-severe ITP patients（non-severe ITP group）， with 120 cases in each group. In addition， 120 health inspectors were selected as the health group. The ratio of cells of Th1 cells， Th17 cells， Regulatory cells（Tregs）， Th17/Treg， natural killer cells（NK）， and dendritic cells（DC）， and interleukin-2（IL-2）， interleukin-6（IL-6）， Tumor Necrosis Factor（TNF-α）， γ-interferon（Interferon-γ， IFN-γ）， immunoglobulin G（IgG） and other immune factor expression levels in the above three groups were detected. And their correlation with ITP conditions and their correlation with each other were analyzed respectively. Results The ratio of Th17， Treg， Th17/Treg and DC in immune cells was significantly correlated with the patient's condition， while the ratio of Th1 and NK cells was not significantly correlated with the patient's condition. The immune factors IL-2， IL-6， TNF-α， IFN-γ was significantly associated with the patient's condition， and IgG was not significantly associated with the patient's condition. Correlation analysis between immune cells and immune factors in ITP showed that the ratio of Th1 cells was positively correlated with IL-2， IL-6 and TNF-α; the ratio of Th17 cells was significantly positively correlated with IL-2， IL-6 and IFN-γ; the proportion of Treg cells was significantly negatively correlated with IL-2， IL-6， TNF-α and IFN-γ; the ratio of Th17/Treg cells was significantly positively correlated with IL-2， IL-6， TNF-α， IFN-γ and IgG. NK cell ratio was significantly positively correlated with IL-6， TNF-α and IFN-γ; DC ratio was significantly positively correlated with IL-2， IL-6 and TNF-α. Conclusion The imbalance of cellular immunity causes abnormal levels of immune factors in the body， which is a contributing factor to the development of ITP.

[Key words] ITP; T cell subsets; NK cells; Dendritic cell subsets; Immune factors

成人慢性免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）是一種發(fā)病率較高的免疫性血液疾病[1]，主要表現(xiàn)為血小板計(jì)數(shù)減少、皮膚黏膜出血、骨髓核細(xì)胞增多等癥狀[2]。ITP發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，人體內(nèi)多環(huán)節(jié)、多因素共同作用導(dǎo)致ITP的發(fā)生發(fā)展，免疫功能失衡及相關(guān)細(xì)胞因子紊亂是其中一個(gè)環(huán)。目前，已有研究證實(shí)細(xì)胞免疫失衡可誘導(dǎo)和促進(jìn)ITP的發(fā)生發(fā)展[3-5]。本研究選取多個(gè)免疫細(xì)胞亞型及免疫因子，分析其與ITP病情發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。并據(jù)此進(jìn)一步分析多個(gè)免疫細(xì)胞亞型與免疫因子之間的關(guān)系，深入探討ITP中細(xì)胞免疫失衡與免疫因子的關(guān)系，為臨床診斷治療ITP提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年11月～2017年3月期間我院血液科收治的240例ITP患者，根據(jù)國際ITP工作組提出的ITP診斷標(biāo)準(zhǔn)[6，7]分為非重度ITP（非重度ITP組，n=120）和重度ITP患者（重度ITP組，n=120），另外選擇門診及體檢部門健康體檢人員120例，作為健康組。非重度ITP組患者中男48例，女72例;年齡27～65歲，平均（47.04±6.25）歲;重度ITP組患者中男51例，女69例;年齡32～68歲，平均（48.54±7.18）歲;健康組受檢人員中男57例，女63例;年齡18～73歲，平均（46.86±7.97）歲。三組一般資料比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

本研究納入排除標(biāo)準(zhǔn)參考許澄偉等[8]研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）簽署書面知情同意書;（2）ITP診斷符合《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國專家共識（2016年版）》[8]，重度ITP血小板小于10×109/L，就診時(shí)合并活動性出血需要更換其他升血小板藥物或加大原先服用藥物劑量;（3）健康組受檢人員體檢結(jié)果確認(rèn)健康;（4）未合并心、肝、肺、腎等臟器嚴(yán)重器質(zhì)性損傷;（5）初診患者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）繼發(fā)性血小板減少癥、假性血小板減少癥等;（2）合并其他免疫性疾病;（3）合并全身感染;（4）研究入組前3個(gè)月內(nèi)服用免疫制劑;（5）妊娠期或哺乳期婦女。

1.2 方法

1.2.1 外周血Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞? 取受檢者清晨抗凝靜脈血200 μL置于流式細(xì)胞管，每管加入1 μg/mL PMA工作液100 μL、50 μg/mL Ionomycin工作液8 μL、0.5 mg/mL Monensin工作液8 μL，注入RPMI-1640培養(yǎng)基，混勻，37℃培養(yǎng)4～6 h。每管加入EDTA 40 μL，混勻，避光孵育15 min。加入預(yù)處理細(xì)胞液100 μL、CD3-FITC和CD8-Percp-cy5.5各6 μL，混勻，避光孵育15 min。加入BD FACS 紅細(xì)胞裂解液2 mL，混勻，避光孵育8～10 min。1500轉(zhuǎn)/min離心5 min，棄上清液，加入BD intrasur kit 破膜劑 50 μL。Th1檢測流式細(xì)胞管加入INF-r-PE 6 μL，Th17檢測流式細(xì)胞管加入IL-17-PE 6 μL，混勻，避光孵育15 min。每管加入PBS 2 mL，混勻，1500轉(zhuǎn)/min離心5 min，棄上清液，加入PBS 1000 μL重懸，使用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.2 外周血自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）? ? 取清晨抗凝靜脈血200 μL置于流式細(xì)胞管，每管加入CD3-FITC、CD16-APC、CD56-APC、CD16-FITC抗體各5 μL，同時(shí)設(shè)立同型陰性對照。25℃避光孵育30 min，1500轉(zhuǎn)/min離心5 min，棄上清液，加入PBS 1 mL，混勻。1500轉(zhuǎn)/min離心5 min，棄上清液，加入PBS 1000 μL重懸，使用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.3 外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory cells，Tregs）? ? 取受檢者清晨抗凝靜脈血200 μL置于流式細(xì)胞管，每管加入CD4-FITC 20 μL和CD25-APC 2.5 μL，混勻，避光孵育15min。加入BD intrasureTM kit破膜劑1 mL，混勻，避光孵育30 min。1500轉(zhuǎn)/min離心5 min，棄上清液，加入透性緩沖液1 mL，混勻。1500轉(zhuǎn)/min離心5 min，棄上清液，加入Foxp3-PE 5 μL，避光孵育40 min。加入透性緩沖液2 mL，混勻，1500轉(zhuǎn)/min離心5 min，棄上清液，加入PBS 1000 μL重懸，使用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 外周血樹突狀細(xì)胞（Dendritic cells，DC）? 取受檢者清晨抗凝靜脈血200 μL，置于流式細(xì)胞管，加入Lin1-FITC、CD123PE、HLA-DR-PerCP混合液6 μL，同時(shí)設(shè)立同型陰性對照。25℃避光孵育15 min，加BD FACS紅細(xì)胞裂解液400 μL，混勻，25℃避光8～10 min。加入2 mL PBS，混勻，1500轉(zhuǎn)/min離心5 min，棄上清液。加入1000 μL PBS重懸，使用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5 血清白介素-2（Interleukin-2，IL-2）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF-α）、γ-干擾素（Interferon-γ，IFN-γ）、免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）? 取受檢者清晨抗凝靜脈血5 mL，采用BN-100全自動生化分析儀（雅培，美國）進(jìn)行測定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

研究采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。Th1、Th17、Treg、Th17/Treg、NK細(xì)胞、DC細(xì)胞表達(dá)和IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ、IgG水平等均為計(jì)量資料，以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，免疫細(xì)胞和免疫因子與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)性分析;免疫細(xì)胞表達(dá)和免疫因子水平之間的相關(guān)性采用Pearson直線相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 三組T細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞亞群表達(dá)情況

Th1、Th17、Th17/Treg、DC水平在健康組、非重度ITP組、重度ITP組均依次明顯升高（F=8.429、8.436、12.451、7.388，P<0.05）;Treg在健康組、非重度ITP組、重度ITP組依次明顯降低（F=6.862，P<0.05）;三組NK細(xì)胞水平比較無顯著差異（F=2.974，P>0.05）;相關(guān)性分析顯示，Th17、Treg、Th17/Treg和DC與ITP病情呈顯著正相關(guān)，Th1、NK細(xì)胞與ITP病情無顯著相關(guān)性。見表1。

2.2 三組IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ、IgG水平比較

IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ、IgG水平在健康組、非重度ITP組、重度ITP組均依次明顯升高（F=12.658、11.042、16.353、12.462、8.326，P<0.05）;相關(guān)性分析顯示，IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ與ITP病情呈顯著正相關(guān)，IgG與ITP病情無顯著相關(guān)性。見表2。

2.3 免疫因子水平和免疫細(xì)胞表達(dá)在ITP中的相關(guān)性研究

Pearson相關(guān)性分析顯示，Th1細(xì)胞百分比與IL-2、IL-6、TNF-α呈顯著正相關(guān)（r=0.625、0.592、0.575，P<0.05），相關(guān)性依次降低;Th17細(xì)胞百分比與IL-2、IL-6、IFN-γ呈顯著正相關(guān)（r=0.785、0.652、0.588，P<0.05），相關(guān)性依次降低;Treg細(xì)胞百分比與TNF-α、IL-6、IL-2、IFN-γ呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.653、-0.638、-0.581、-0.579，P<0.05），相關(guān)性依次降低;Th17/Treg與IL-6、TNF-α、IL-2、IFN-γ、IgG呈顯著正相關(guān)（r=0.826、0.733、0.715、0.626、0.615，P<0.05），相關(guān)性依次降低;NK細(xì)胞百分比與TNF-α、IFN-γ、IL-6呈顯著正相關(guān)（r=0.869、0.731、0.634，P<0.05），相關(guān)性依次降低;DC細(xì)胞百分比與IL-6、IL-2、TNF-α呈顯著正相關(guān)（r=0.600、0.561、0.541，P<0.05），相關(guān)性依次降低。見表3。

3討論

ITP是一種獲得性自身免疫性疾病，其發(fā)病已被證實(shí)與免疫功能和造血祖/干細(xì)胞異常等多種因素有關(guān)[9]。曹江等[10]研究指出，ITP患者外周血中IL22水平明顯升高，Th1、Th22細(xì)胞可能通過刺激機(jī)體大量合成和分泌IL-22以促進(jìn)ITP發(fā)病。曠文勇等[11]研究中發(fā)現(xiàn)，T淋巴細(xì)胞亞群與DC亞群比例失衡可促進(jìn)兒童持續(xù)性慢性ITP的發(fā)病，并與患兒ITP臨床分期和預(yù)后顯著相關(guān)。

T細(xì)胞是人體免疫網(wǎng)絡(luò)中最重要的免疫細(xì)胞，參與機(jī)體各項(xiàng)免疫調(diào)節(jié)，被證實(shí)與ITP疾病有密切聯(lián)系。T細(xì)胞分為Th1/Th2細(xì)胞、Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞等，其中Th細(xì)胞主要起輔助作用，能促進(jìn)T細(xì)胞和B細(xì)胞分別轉(zhuǎn)化為效應(yīng)細(xì)胞和漿細(xì)胞。既往研究[12]表明，ITP患者中存在Th1/Th2平衡紊亂。Th17細(xì)胞是近年來新發(fā)現(xiàn)的效應(yīng)CD4+T細(xì)胞，被證實(shí)與多種自身免疫疾病相關(guān)。Rocha等[13]研究發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞表達(dá)及細(xì)胞相關(guān)因子水平在ITP患者中均顯著升高。Th17細(xì)胞分泌的IL-17A炎癥細(xì)胞因子與受體結(jié)合，可活化MAP激酶和核因子-κB發(fā)揮生物活性，引起機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能紊亂[14]。Treg細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子IL-10、TGF-β等參與機(jī)體免疫耐受及免疫調(diào)節(jié)[15]。最新研究[16]顯示，IL-17A和IL-21通過Th17細(xì)胞相關(guān)信號通路能誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的生成和抑制Treg細(xì)胞再分化，CD16+單核細(xì)胞可促進(jìn)Th1細(xì)胞增殖，負(fù)向調(diào)控Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞，Th1/Th17/Treg平衡紊亂可能是ITP疾病潛在的治療靶點(diǎn)。DC在人體免疫網(wǎng)絡(luò)中專職抗原遞呈細(xì)胞，具有一定的免疫刺激作用。凌云等[17]研究報(bào)道中，提出ITP患者外周血髓系和淋系DC數(shù)目與正常對照無顯著差異，但治療后淋系DC數(shù)目明顯下降，ITP患者DC細(xì)胞水平存在異常。NK細(xì)胞在ITP中的作用尚未明確，有研究[18]發(fā)現(xiàn)ITP患兒的NK細(xì)胞百分比低于正常兒童，但在急性ITP患兒中與正常兒童比較無顯著差異[12]。因此，考慮NK細(xì)胞在ITP中屬于下游調(diào)節(jié)因子。

研究中，Th1、Th17、Th17/Treg、DC水平在健康組、非重度ITP組、重度ITP組均依次明顯升高，Treg水平在健康組、非重度ITP組、重度ITP組明顯降低。進(jìn)一步分析顯示，Th17、Treg、Th17/Treg、DC細(xì)胞水平均與患者病情呈明顯相關(guān)性，表明T細(xì)胞和DC細(xì)胞參與成人ITP的發(fā)生與發(fā)展，免疫細(xì)胞在ITP發(fā)生發(fā)展中具有顯著的促進(jìn)作用。NK細(xì)胞對ITP影響較小，可能是通過T淋巴細(xì)胞發(fā)揮作用。研究顯示三組NK細(xì)胞比較無顯著差異（P>0.05），一方面可能與研究納入樣本量不足有關(guān)，另一方面考慮為不同受檢群體和不同類型的ITP發(fā)病機(jī)制存在差異。

研究選取多個(gè)免疫因子分析其與ITP疾病的相關(guān)性，顯示IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ與ITP病情呈顯著相關(guān)性，可見免疫因子與ITP疾病有密切聯(lián)系。ITP的主要免疫細(xì)胞異常在于Th細(xì)胞缺陷，Th1細(xì)胞可分泌IL-2、TNF-α、IFN-γ等促炎因子，增強(qiáng)T細(xì)胞的殺傷活性，激活巨噬細(xì)胞和毒性T細(xì)胞[19]。Olsson等[20]研究指出，IL-2可能通過促進(jìn)T細(xì)胞的直接細(xì)胞毒效應(yīng)導(dǎo)致血小板被破壞;促使B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生大量抗血小板抗體;刺激巨噬細(xì)胞的吞噬能力，使血小板被單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)清除。TNF-α在體內(nèi)可促進(jìn)T細(xì)胞主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類抗原的表達(dá)，并增強(qiáng)T細(xì)胞以及B細(xì)胞的免疫應(yīng)答能力。IFN-γ具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用，可促進(jìn)B細(xì)胞增殖分化成漿細(xì)胞，并增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞功能。研究[21]認(rèn)為，ITP患者血清IFN-γ升高可能導(dǎo)致血小板相關(guān)抗體分泌增多，巨噬細(xì)胞對血小板的破壞增強(qiáng)。IL-6由Th2細(xì)胞分泌，研究顯示，ITP患者血清中IL-6水平升高，主要與其促進(jìn)B細(xì)胞增殖、分化，促使機(jī)體產(chǎn)生血小板抗體和增強(qiáng)單核巨噬吞噬功能有關(guān)。IL-6與TGF-β可誘導(dǎo)初始CD+4T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞，消除Treg細(xì)胞的抑制功能，誘導(dǎo)ITP發(fā)病。此外，IL-6還具有促進(jìn)巨核細(xì)胞發(fā)育、成熟和分化生成血小板等作用。進(jìn)一步分析免疫細(xì)胞與免疫因子水平在ITP患者中聯(lián)系，顯示兩者在ITP患者中具有顯著正相關(guān)性，免疫細(xì)胞可能是通過調(diào)控免疫因子的分泌參與ITP疾病的發(fā)生與發(fā)展。因此，臨床診療ITP時(shí)需重點(diǎn)關(guān)注患者免疫水平的變化，免疫調(diào)節(jié)可作為未來ITP診療的研究重點(diǎn)和可能的治療研究方向。

綜上所述，免疫細(xì)胞和免疫因子與ITP疾病有密切聯(lián)系，細(xì)胞免疫失衡可引起機(jī)體免疫因子水平異常，可能是ITP發(fā)生發(fā)展的致病機(jī)制之一。然而，由于時(shí)間、研究條件等多種因素限制，本次研究結(jié)果可能存在一定偏倚。后續(xù)仍需要更多大樣本量、多中心的研究加以論證，進(jìn)一步探討免疫調(diào)節(jié)在成人ITP中的作用機(jī)制。

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（收稿日期：2019-02-28）