張建文,王宏亮,鄧 瓊,梁 輝,王 鑄

(深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科,廣東深圳 518109)

前列腺癌是全球男性發(fā)病率最高的癌癥之一,死亡率位居男性腫瘤的第2位[1-2],并且其發(fā)病率還在不斷攀升。統(tǒng)計(jì)分析認(rèn)為,到2030年,在高于65歲的男性人群中前列腺癌患者將占到19.6%[3]。近年來(lái),隨著我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、生活條件的不斷改善、老年人口比例的逐漸增多以及臨床診斷技術(shù)水平的快速提高,前列腺癌的發(fā)病率在我國(guó)男性人群中逐年升高[4]。

前列腺癌病情易被忽視,晚期前列腺癌惡化速度顯著加快,通常都會(huì)發(fā)展成為去勢(shì)抵抗前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)并且容易轉(zhuǎn)移到其他內(nèi)臟器官,例如骨骼和淋巴結(jié)[5-6]。面對(duì)晚期癥狀性CRPC,目前臨床上基本沒(méi)有有效的治療手段,預(yù)后極差[7]。到目前為止,前列腺癌的確切發(fā)病以及進(jìn)展機(jī)制尚未完全清楚。因此,對(duì)于前列腺癌的研究，尤其是對(duì)CRPC發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究十分迫切。本研究中發(fā)現(xiàn)維甲酸相關(guān)的孤兒核受體β(retinoic acid-related orphan receptor β,RORβ)在前列腺癌組織中顯著上調(diào)表達(dá),并且在前列腺癌腫瘤干細(xì)胞富集的腫瘤多細(xì)胞球中表達(dá)水平進(jìn)一步升高。我們還構(gòu)建了基于VCaP細(xì)胞的CRPC小鼠模型,發(fā)現(xiàn)在腫瘤復(fù)發(fā)階段RORβ表達(dá)水平顯著高于去勢(shì)之前的腫瘤標(biāo)本。我們?cè)赩CaP-CRPC模型的腫瘤復(fù)發(fā)階段,發(fā)現(xiàn)了腫瘤干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著高于去勢(shì)之前的腫瘤標(biāo)本。通過(guò)外源性過(guò)表達(dá)的方式在前列腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)RORβ的表達(dá)水平,并通過(guò)腫瘤多細(xì)胞球形成實(shí)驗(yàn),以及抗雄激素藥物處理發(fā)現(xiàn)RORβ過(guò)表達(dá)的前列腺癌細(xì)胞具有顯著增強(qiáng)的腫瘤多細(xì)胞球形成能力,并具有更強(qiáng)的抗雄激素藥物耐受能力。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料前列腺癌細(xì)胞株DU145、LNCaP和VCaP購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù),分別用含有10%胎牛血清(forward-based system,FBS)的MEM培養(yǎng)基(Gibco minimum eagle’s media,MEM),RMPI1640(Gibco RPMI 1640 medium)以及DMEM培養(yǎng)基(Gibco Dulbecco’s modified eagle medium,DMEM)培養(yǎng)。鼠抗人RORβ單抗購(gòu)自Abcam公司(貨號(hào)：ab228650),鼠抗人β-actin單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz生物科技公司(貨號(hào)：sc-47778)；RORβ基因的表達(dá)克隆從DNASU Plasmid Repository購(gòu)買(ID：HsCD00300034)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1前列腺癌多細(xì)胞球培養(yǎng) 前列腺癌細(xì)胞通過(guò)胰酶(0.05% Trypsin-EDTA)消化成單個(gè)細(xì)胞后,用PBS洗3次,DMEM/F12培養(yǎng)基[添加10 ng/mL表皮生長(zhǎng)因子,10 ng/mL 堿性成纖維細(xì)胞因子,2% B-27(體積分?jǐn)?shù)),5 μg/mL胰島素,1%敲除替代血清(體積分?jǐn)?shù)),1%青霉素和鏈霉素(體積分?jǐn)?shù))]重懸,按照1×105個(gè)細(xì)胞接種到100 mm超低吸附培養(yǎng)皿(ultra-low attachment dishes and plates,康寧,美國(guó))。37 ℃條件下培養(yǎng)5 d后,每2～3 d更換培養(yǎng)基至2周,用孔徑80 μm的濾膜過(guò)濾收集細(xì)胞球用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2VCaP-CRPC動(dòng)物模型建立 將前列腺癌VCaP細(xì)胞(2×106個(gè)細(xì)胞/50 μL與基質(zhì)膠1∶1混合)皮下注射到6～8周齡雄性嚴(yán)重免疫力缺乏綜合癥(severe combined immunodeficiency,SCID)小鼠體內(nèi),每周觀察并測(cè)算腫瘤體積1次,腫瘤體積約0.8 cm3時(shí),宿主小鼠被麻醉并施行去勢(shì)手術(shù),正常飼養(yǎng)至約14周,復(fù)發(fā)的腫瘤異種移植物生長(zhǎng)至約1.2 cm3,施行麻醉過(guò)量人道處死小鼠并去除瘤體。分別在進(jìn)行去勢(shì)手術(shù)前,去勢(shì)后4 d以及去勢(shì)后8周(腫瘤去勢(shì)復(fù)發(fā))收取腫瘤標(biāo)本,用于RORβ基因mRNA以及蛋白表達(dá)分析。

1.2.3Oncomine數(shù)據(jù)分析 在Oncomine(http:∥www.oncomine.org)分析中,使用癌癥基因組圖譜(the Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù),在前列腺癌臨床樣本和正常前列腺組織中分析RORβ基因的mRNA表達(dá)水平。用于分析的參數(shù)包括RORβ(NR1F2)為基因名稱,以前列腺癌為分析對(duì)象,以癌癥與正常組織中的表達(dá)水平作為分析類型。用于查詢微陣列數(shù)據(jù)閾值：包括癌組織和正常組織之間的表達(dá)差異>2,P<1×10-4。

1.2.4RORβ過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建 RORβ基因克隆購(gòu)自DNASU Plasmid Repository(Arizona State University),通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增獲取全長(zhǎng)cDNA,并將其克隆入慢病毒質(zhì)粒pLenti-puro進(jìn)行過(guò)表達(dá)研究。將構(gòu)建的pLenti-RORβ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293FT細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝制備(實(shí)驗(yàn)組),空的pLenti-puro載體包裝作為陰性對(duì)照(對(duì)照組)。包裝好的病毒分別用來(lái)感染LNCaP和DU145細(xì)胞,分別通過(guò)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)和免疫印跡(Western blot)分析驗(yàn)證RORβ蛋白水平的表達(dá)。

1.2.5RT-PCR實(shí)驗(yàn) 使用抽提試劑(Trizol)法提取細(xì)胞以及腫瘤組織總RNA,并用脫氧核糖核酸酶I(DNaseI)處理。使用PrimeScript RTase和oligo-dT(PrimeScript RT Master Mix,TaKaRa)的混合物在37 ℃下15 min合成第一鏈cDNA,然后在85 ℃下5 s熱滅活逆轉(zhuǎn)錄酶(RTase)。使用熒光定量檢測(cè)試劑盒綠色熒光的方法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。通過(guò)混合25 ng cDNA,150 nmol/L引物對(duì)和熒光定量混合物(SYBR Premix Ex Taq,ROX Plus,TaKaRa)并在實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(StepOne,Applied Biosystems)中以95 ℃ 20 s進(jìn)行PCR反應(yīng),隨后再以95 ℃ 15 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s為一個(gè)循環(huán)周期進(jìn)行40次。

1.2.6Western blot實(shí)驗(yàn) 使用冷裂解緩沖液(20 mmol/L PIPES,0.1%十二烷基硫酸鈉,1 mmol/L乙二胺四乙酸,1 mmol/L乙二醇雙四乙酸,10 mmol/L一硫代甘油,1 mmol/L蛋白酶抑制劑,5 mmol/L亮抑酶肽,0.25 mol/L蔗糖)提取全細(xì)胞蛋白。在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)分離和轉(zhuǎn)印到聚偏氟乙烯膜上后,一級(jí)和二級(jí)抗體孵育,隨后用免疫印跡檢測(cè)系統(tǒng)(ECL Western blotting detection system,amersham)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0軟件。定量資料進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA),方差不齊者采用秩和檢驗(yàn)分析,樣本間的兩兩比較采用最小顯著性差異法(least significant difference,LSD)方法分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RORβ在前列腺癌組織中表達(dá)水平顯著升高通過(guò)生物信息學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)RORβ在前列腺癌臨床樣本中的表達(dá)水平顯著升高(圖1)。在兩個(gè)獨(dú)立的研究中,分別調(diào)查了65例和27例前列腺癌臨床樣本,正常前列腺對(duì)照組分別有23例和8例。研究發(fā)現(xiàn),相對(duì)于正常前列腺組織,RORβ在前列腺癌組織中顯著升高(P<0.001)。

圖1 RORβ在前列腺癌組織中表達(dá)水平升高

2.2 RORβ在前列腺癌多細(xì)胞模型中的表達(dá)水平顯著升高分析RORβ基因在前列腺癌細(xì)胞LNCaP、VCaP以及DU145細(xì)胞多細(xì)胞球(prostatospheroids)中的表達(dá)(圖2A、B)。結(jié)果顯示,無(wú)論是雄激素依賴型(LNCaP、VCaP)還是雄激素非依賴型細(xì)胞株(DU145)形成的多細(xì)胞球,RORβ基因都發(fā)生了顯著的上調(diào)表達(dá),其中在LNCaP細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)最為顯著(圖2C,P<0.001),Western blot驗(yàn)證了RORβ在蛋白水平的上調(diào)表達(dá)(圖2D)。

圖2 RORβ在前列腺癌多細(xì)胞模型中的表達(dá)水平顯著升高

2.3 RORβ在前列腺癌去勢(shì)抵抗動(dòng)物模型中的表達(dá)水平顯著升高我們通過(guò)構(gòu)建CRPC小鼠模型,分析RORβ在CRPC小鼠模型的各個(gè)階段的表達(dá)情況,結(jié)果顯示在去勢(shì)過(guò)程中,RORβ表達(dá)顯著上調(diào),隨著腫瘤的復(fù)發(fā)RORβ表達(dá)水平有所下降,但仍然顯著高于去勢(shì)手術(shù)前的表達(dá)水平(圖3A)。在去勢(shì)手術(shù)后CRPC小鼠模型各個(gè)階段腫瘤標(biāo)本中腫瘤干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物(CD44、CD133、OCT4、CK5等)的表達(dá)水平顯著升高(圖3B)。另外,在CRPC模型中RORβ蛋白表達(dá)水平顯著升高(圖3C)。我們通過(guò)流式細(xì)胞儀(fluorescence-activated cell sorting,FACS)分析VCaP-CRPC組織標(biāo)本中CD44+/CD133+細(xì)胞,結(jié)果顯示CD44+/CD133+陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著升高。

圖3 RORβ在前列腺癌去勢(shì)抵抗動(dòng)物模型中的表達(dá)水平顯著升高

A：RORβ在VCaP-CRPC模型中的表達(dá)水平；B：VCaP-CRPC模型中前列腺癌干細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá),*P<0.05,**P<0.001；C：VCaP-CRPC模型中RORβ蛋白表達(dá)水平。

2.4 RORβ在前列腺癌細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)促進(jìn)前列腺癌腫瘤干細(xì)胞富集的多細(xì)胞球的形成通過(guò)構(gòu)建RORβ真核表達(dá)載體,我們分別在DU145(雄激素非依賴型細(xì)胞)和LNCaP(雄激素依賴型細(xì)胞)細(xì)胞中外源性過(guò)表達(dá)RORβ,在mRNA以及蛋白水平的表達(dá)(圖4A、B),RORβ的過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)前列腺癌腫瘤干細(xì)胞富集的腫瘤多細(xì)胞球的形成(圖4C、D)。

圖4 RORβ在前列腺癌細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)促進(jìn)前列腺癌腫瘤干細(xì)胞富集的多細(xì)胞球的形成

A、B：RORβ過(guò)表達(dá)載體在DU145和LNCaP細(xì)胞中的表達(dá)驗(yàn)證；C、D：RORβ過(guò)表達(dá)促進(jìn)DU145和LNCaP多細(xì)胞球的形成。*P<0.05,**P<0.001。

3 討 論

前列腺癌干細(xì)胞(prostate cancer stem cell,PCSC)被認(rèn)為是前列腺癌的起始細(xì)胞,不僅可以分化成前列腺癌細(xì)胞,還具有自我更新能力,保持自身在腫瘤細(xì)胞中的一定比例。前列腺癌干細(xì)胞因?qū)熀头暖煵幻舾?而且雄激素受體表達(dá)陰性,對(duì)雄激素治療不敏感,是導(dǎo)致前列腺癌復(fù)發(fā)以及CRPC進(jìn)展的重要機(jī)制[10]。

本項(xiàng)研究中,我們發(fā)現(xiàn)核受體RORβ在前列腺癌細(xì)胞以及CRPC動(dòng)物模型中顯著上調(diào)表達(dá),并且通過(guò)真核載體外源性的上調(diào)RORβ表達(dá)可以顯著促進(jìn)前列腺癌干細(xì)胞富集的腫瘤多細(xì)胞球的形成。核受體是一類轉(zhuǎn)錄因子超家族,其通過(guò)配體依賴性或者配體非依賴性的方式調(diào)控下游基因表達(dá),在新陳代謝、生殖、發(fā)育等生理過(guò)程中起著重要的作用[11]。RORβ可能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞相關(guān)信號(hào)通路和蛋白因子從而介導(dǎo)了前列腺癌干細(xì)胞的自我更新和分化。因此,RORβ可能成為治療CRPC潛在的新靶點(diǎn)。

研究發(fā)現(xiàn),核受體配體結(jié)合域可以被天然代謝產(chǎn)物、激素或者小分子藥物結(jié)合,并由此調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性,因此被認(rèn)為是癌癥治療的理想靶點(diǎn)。例如糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor,GR)可以拮抗雄激素受體(androgen receptor,AR)信號(hào)通路,因此GR通常也作為單獨(dú)化療或者聯(lián)合治療手段應(yīng)用于CRPC的治療[12-13]；維生素D受體可以和AR信號(hào)通路發(fā)生交互作用,調(diào)節(jié)雄激素代謝過(guò)程并抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖[14]。到目前為止,已經(jīng)有多種靶向核受體的小分子藥物上市或者進(jìn)入臨床試驗(yàn)。例如靶向雌激素受體(estrogen receptor,ER)的小分子雌激素拮抗藥它莫西芬(Tamoxifen)和特異性更高的雷洛昔芬(Raloxifene),被用于治療乳腺癌[15],靶向AR的非甾體類小分子藥物Flutamide、Bicalutamide、MDV-3100,被用于治療前列腺癌[16],靶向核受體PPARs的激動(dòng)劑(Thiazolinediones,TZDs)被用于治療2型糖尿病、脂肪肉瘤和結(jié)腸癌[17]等。

RORβ屬于孤兒核受體家族,在維持各種生理過(guò)程和生理節(jié)律方面起著重要的調(diào)節(jié)作用[16]。晝夜節(jié)律異常越來(lái)越被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的重要誘因[18-19]。因此,闡明RORβ的分子機(jī)制,調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)晝夜節(jié)律異?？赡軐?duì)有效干預(yù)和阻斷異常晝夜節(jié)律誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生產(chǎn)生重要的臨床益處[18]。目前RORβ基因異常表達(dá)與人類癌癥的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系日益受到關(guān)注。RISINGER等[21]對(duì)79例子宮內(nèi)膜癌以及12例1期漿液性子宮內(nèi)膜癌研究發(fā)現(xiàn),相對(duì)于正常子宮內(nèi)膜組織,RORβ在組織中顯著低表達(dá)[20]。另外,研究表明在結(jié)直腸癌中也發(fā)現(xiàn)RORβ在癌組織中顯著下調(diào)表達(dá)。然而,DAVIDSON等[20]在原發(fā)性子宮肌肉瘤中發(fā)現(xiàn)RORβ表達(dá)顯著上調(diào)。但是,RORβ激活或者抑制腫瘤生長(zhǎng)的調(diào)控機(jī)制尚不明確。

有研究通過(guò)mRNA FISH和RT-PCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)RORβ在胃癌組織中下調(diào),RORβ通過(guò)與Nrip2/Rorl3/HBPl分子間的相互作用影響Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性而調(diào)控大腸癌細(xì)胞自我更新[21-23]。Wnt/β-catenin可以直接作用于腫瘤干細(xì)胞因子Nanog和Oct4啟動(dòng)子上調(diào)其表達(dá)水平,從而促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞干性維持過(guò)程[24]。因此RORβ促進(jìn)前列腺癌多細(xì)胞球的形成可能與Wnt/β-catenin信號(hào)以及Nanog和Oct4的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。另外,GREINER等[25]新發(fā)現(xiàn)NIX1通過(guò)第61～99個(gè)氨基酸與RORβ相互作用,直接結(jié)合RORβ且特異性地抑制其活性。RORβ的異常表達(dá)可能與其上游信號(hào),包括NIX1的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述,核受體RORβ在前列腺癌細(xì)胞以及CRPC動(dòng)物模型中上調(diào)表達(dá),并可能通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路介導(dǎo)Nanog以及Oct4的表達(dá)從而促進(jìn)前列腺癌干細(xì)胞富集的多細(xì)胞球的形成。這表明RORβ很可能通過(guò)調(diào)控前列腺癌干細(xì)胞干性從而促進(jìn)了前列腺癌去勢(shì)抵抗進(jìn)展,提示核受體RORβ有可能是一個(gè)潛在的前列腺癌進(jìn)展標(biāo)記物和治療靶點(diǎn),但是其相關(guān)信號(hào)通路以及調(diào)控機(jī)制仍不清楚亟待進(jìn)一步研究。