李翰陽(yáng)，張尚衡，王耀坤，王芳芳，張慧明，蘇菊香，陳 光

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

糖尿病是以血糖升高為特征，由胰島素分泌缺乏或功能障礙導(dǎo)致糖代謝紊亂引起的代謝性疾病。截止2008年，世界上成人糖尿病患者約3.46億，預(yù)計(jì)2030年，糖尿病發(fā)病人數(shù)將達(dá)到40億[1]。根據(jù)最近流行病學(xué)的調(diào)查結(jié)果估計(jì)糖尿病人當(dāng)中90%以上為T2DM[2]。目前，傳統(tǒng)治療藥物或增強(qiáng)胰島素的分泌，或?qū)挂葝u素抵抗，或減少葡萄糖的吸收，增加糖的利用等，但這些藥物都因不同程度的副作用或易使機(jī)體產(chǎn)生耐藥性而無(wú)法達(dá)到理想的治療效果。因此，尋找新的藥物作用靶點(diǎn)或有效的治療方法一直是糖尿病治療研究的熱點(diǎn)。

雖然胰腺移植和胰島移植不能成為治療復(fù)雜糖尿病的常規(guī)治療手段，但是細(xì)胞移植的成功為干細(xì)胞治療開啟了一扇大門。UC-MSCs來(lái)源豐富，再生能力強(qiáng)；并且其表面抗原性很弱，不被受體的免疫系統(tǒng)所識(shí)別，移植物抗宿主病極少見(jiàn)，可以忽略人類白細(xì)胞抗原(HLA)配型問(wèn)題[3-4]。因此，UC-MSCs作為一新干細(xì)胞來(lái)源，較骨髓干細(xì)胞，有更加易于采集、存儲(chǔ)、抗原性小、被病毒及癌細(xì)胞污染可能性小等優(yōu)點(diǎn)[5-6]，正日益受到重視。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)腹腔途徑移植UC-MSCs，觀察db-/db-小鼠血糖及體重的變化，記錄生存率，明確UC-MSCs對(duì)db-/db-小鼠的臨床療效及有效的移植途徑，為臨床應(yīng)用UC-MSCs治療糖尿病提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料db/m及db-/db-小鼠，體重18～22g及35～39 g，7～8周齡，雄性；由南京大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK(蘇)2015-0001。實(shí)驗(yàn)室正常飼養(yǎng)，自由攝食與飲水，室溫 20～25℃，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用及處理標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究護(hù)理。

1.2 主要試劑與儀器UC-MSCs(由吉林拓華生物科技有限公司提供)，1mL注射器(日本Terumo)，血糖儀(羅氏卓越型)，體重秤，高脂高糖飼料等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及UC-MSCs移植 將db/m和db-/db-小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7d，觀察并記錄小鼠血糖、體重及精神狀態(tài)。將db/m和db-/db-小鼠共分為4組：db/m對(duì)照組，db/m+UC-MSCs組，db-/db-模型組，db-/db-+UC-MSCs組，5只/組。對(duì)照組和模型組給予1mL生理鹽水腹腔注射；db/m+UC-MSCs和db-/db-+UC-MSCs組給予等液體量腹腔注射UC-MSCs為1×107個(gè)細(xì)胞/只鼠；UC-MSCs移植后，各組小鼠使用高脂高糖飼料喂養(yǎng)20周[7]。

1.3.2 體重和血糖的測(cè)定 小鼠注射UC-MSCs后適應(yīng)性觀察2d，隨后每周血糖儀監(jiān)測(cè)并記錄各組小鼠餐后血糖和體重的變化情況，每隔2周測(cè)量一次小鼠空腹血糖。同時(shí)記錄在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)的小鼠死亡現(xiàn)象。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用 SPSS 19.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，組間比較采用t檢驗(yàn)及方差分析，以P<0. 05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腹腔注射途徑移植UC-MSCs對(duì)db-/db-小鼠餐后血糖的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與db-/db-模型組小鼠相比，腹腔途徑移植UC-MSCs可明顯降低db-/db-小鼠的血糖水平，見(jiàn)圖1。

2.2 腹腔注射途徑移植UC-MSCs對(duì)db-/db-小鼠體重的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與db-/db-模型組小鼠相比，腹腔途徑移植UC-MSCs后db-/db-小鼠的體重?zé)o明顯變化，見(jiàn)圖2。

圖1 腹腔注射途徑移植UC-MSCs對(duì)db-/db-小鼠餐后血糖的影響

圖2 腹腔注射途徑移植UC-MSCs對(duì)db-/db-小鼠體重的影響

2.3 腹腔注射途徑移植UC-MSCs對(duì)db-/db-小鼠生存率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腹腔途徑移植UC-MSCs后db-/db-小鼠出現(xiàn)1只死亡，生存率為75%；db/m組、db/m+UC-MSCs組和db-/db-組小鼠均存活，生存率為100%(數(shù)據(jù)未顯示)，見(jiàn)圖3。

圖3 腹腔注射途徑移植UC-MSCs小鼠生存率觀察

3 討論

糖尿病(Diabetes mellitus, DM)是一種常見(jiàn)的代謝綜合征，是僅次于腫瘤、心血管疾病和腦血管疾病后對(duì)人類健康具有嚴(yán)重威脅的慢性病。由于生活水平的提高，運(yùn)動(dòng)量不足和飲食過(guò)剩使得糖尿病成為全球性流行疾病，這種流行性在當(dāng)今社會(huì)顯得尤其突出。除遺傳因素外，T2DM病因被認(rèn)為與肥胖引起的胰島素抵抗有關(guān)[8]。

DM是致殘或早亡的主要原因之一，目前臨床治療無(wú)療效極佳的藥物。因此，迫切需要尋求新的治療藥物與治療策略，細(xì)胞治療有望成為糖尿病治療的重要途徑。間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能、免疫調(diào)節(jié)、造血支持和促進(jìn)干細(xì)胞植入等特點(diǎn)而備受關(guān)注[9]。其中UC-MSCs因其獲取過(guò)程無(wú)創(chuàng)傷、低免疫源性等優(yōu)勢(shì)目前成為了臨床應(yīng)用的熱點(diǎn)。UC-MSCs 對(duì)多種免疫細(xì)胞(T細(xì)胞，B細(xì)胞，NK細(xì)胞和單核細(xì)胞)均能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。并且，UC-MSC 在腫瘤、自身免疫性疾病、急性腎損傷和器官移植等疾病的免疫治療中發(fā)揮重要作用[9]。

本研究通過(guò)腹腔途徑移植UC-MSCs后，觀察了小鼠的一般狀態(tài)和體重、血糖的變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腹腔移植途徑能有效的控制db-/db-小鼠的血糖變化，但是對(duì)體重?zé)o明顯影響。另外，通過(guò)觀察腹腔移植途徑對(duì)小鼠生存率的影響，發(fā)現(xiàn)腹腔注射能引起部分db-/db-小鼠的死亡，結(jié)果證明小鼠死亡原因與腹腔途徑移植UC-MSCs密切相關(guān)，提升臨床應(yīng)用存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。因此臨床應(yīng)用UC-MSCs，需要通過(guò)綜合因素評(píng)估后采用腹腔注射移植。

腹腔注射是臨床上常用的細(xì)胞移植方式。由于UC-MSCs會(huì)產(chǎn)生白介素、腫瘤壞死因子α等細(xì)胞因子，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞因子風(fēng)暴[10-11]從而出現(xiàn)高熱等炎癥發(fā)應(yīng)。因此，在臨床治療中，移植前可采用部分醫(yī)療手段盡量減少UC-MSCs移植后對(duì)患者機(jī)體的損傷，將會(huì)起到可觀的臨床療效。