心血管疾病是導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一，也是導(dǎo)致我國病人猝死的主要原因[1]。隨著人們生活水平的提高，心血管疾病的發(fā)病率和致死率也呈逐年上升趨勢[2-3]。心肌缺血、高血壓、高血脂、糖尿病及過度疲勞均是導(dǎo)致心血管疾病的重要因素[4]。近年來大量研究表明，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡在心血管疾病發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[2， 5]。心肌細(xì)胞是一類高度分化的細(xì)胞，心肌細(xì)胞的凋亡會導(dǎo)致心臟功能減退，最終導(dǎo)致心臟功能衰竭[6]。因此，尋找新的藥物抑制氧化應(yīng)激、減少心肌細(xì)胞凋亡是目前心血管疾病治療研究的熱點。白毛夏枯草是我國常用中草藥，常用于治療風(fēng)濕病、關(guān)節(jié)炎、胃腸道功能紊亂等疾病，具有較強的抗炎活性[6]。哈巴苷(harpagide， HG) 是白毛夏枯草的主要活性成分，近年來研究表明哈巴苷也具有抗炎活性[7]，并且還能對抗谷氨酸鹽誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，從而抑制大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[8]。但其對心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用還少見報道。本研究采用H2O2處理心肌細(xì)胞H9c2，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化損傷，以研究哈巴苷對心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 哈巴苷 (貨號：6926-080-5) 購自上海一研生物科技有限公司，分子式為C15H24O10，分子量為364.35，純度≥98%。DMEM/F12培養(yǎng)液 (貨號：11330032)、胰酶 (貨號：25200114) 和胎牛血清 (貨號：12483020) 購自美國Invitrogen公司，Hoechst 33256染色液 (貨號：C1027)、RIPA裂解液 (貨號：P0013C) 和BCA試劑盒 (貨號：P0010) 購自上海碧云天生物科技公司。超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase， SOD，貨號：A001-3)、丙二醛 (malondiadehyde， MDA，貨號：A003-1)和谷胱甘肽 (glutathione， GSH)試劑盒 (貨號：A006-1) 購自南京建成生物工程研究所。Caspase-3(貨號：ab13847)、Caspase-9(貨號：ab32539)、Bcl-2 (貨號：ab182858) 和Bax (貨號：ab32503) 一抗和山羊抗兔二抗(貨號：ab6721)均購自英國Abcam公司。二氯熒光乙酰乙酸鹽(2’，7’-Dichloroflurescein diacetate， DCF-DA， 貨號：35845) 購自美國Sigma公司。 哈巴苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 哈巴苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠心肌細(xì)胞H9c2購自美國ATCC (貨號：CRL-1466)。用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液將H9c2細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃ 5% 二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，并保持濕度在95%以上，2 d換液1次。細(xì)胞融合率達(dá)到90%以上時對細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，種板密度為1×104個/mL。

1.3 細(xì)胞分組及模型復(fù)制 將細(xì)胞以1×105個/mL的密度接種于6孔板中，隨機分為H9c2組、哈巴苷組、H2O2組和H2O2+哈巴苷組。將細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，H2O2組和H2O2+ 哈巴苷組加入終濃度為150 μmoL的 H2O2處理3 h，隨后哈巴苷組和H2O2+ 哈巴苷組更換為含有4 μmoL 哈巴苷的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，其余兩組更換為正常培養(yǎng)液。24 h后收集上清液，保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.4 CCK8檢測細(xì)胞活性 將細(xì)胞接種于96孔板中，種板密度為1×105個/mL。將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL的CCK8試劑，重新置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后檢測細(xì)胞活性，計算細(xì)胞增殖倍數(shù)，增殖倍數(shù)=細(xì)胞吸光度/0 h H9c2組細(xì)胞吸光度×100%。

1.5 Hoechst染色檢測細(xì)胞凋亡 用H2O2和哈巴苷處理細(xì)胞并吸走上清液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次后，每孔加入500 μL的Hoechst染色液，重新置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)30 min，30 min后用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況，計算細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6 檢測SOD、MDA和GSH活性 取出細(xì)胞培養(yǎng)上清液置于4 ℃冰箱中待其完全融化后再恢復(fù)室溫，用離心機以1 200 r/min的轉(zhuǎn)速離心4 min后，取上清液根據(jù)試劑盒說明書檢測上清液中SOD、MDA和GSH的濃度。

1.7 Western blot檢測蛋白表達(dá) 用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA試劑盒對蛋白質(zhì)含量進(jìn)行定量分析并調(diào)平。用12% SDS-PAGE分離蛋白，采用半干法轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到PVDF膜，并用5%的脫脂牛奶室溫封閉2h。2h后吸去脫脂牛奶，加入Caspase-3(1∶1 000)、Caspase-9 (1∶1 000)一抗、Bcl-2 (1∶1 200)和Bax (1∶1 000)，4 ℃封閉過夜。第2天洗去未結(jié)合一抗，加入二抗 (1∶1 200)，室溫孵育1 h后，洗去未結(jié)合二抗，滴加化學(xué)發(fā)光顯色液曝光顯影。以GAPDH為內(nèi)參，用Image J軟件對蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行定量分析。

1.8 二氯熒光素 (DCF)法檢測活性氧(ROS)活性 將細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞密度為5×105個/mL。培養(yǎng)24 h后，加入 10 μmoL的DCF-DA，室溫孵育10 min后，加入4%的多聚甲醛室溫固定細(xì)胞5 min，用流式細(xì)胞儀檢測DCF的熒光強度。

2 結(jié) 果

2.1 哈巴苷對心肌細(xì)胞增殖的影響 與H9c2組比較，哈巴苷組細(xì)胞增殖倍數(shù)無明顯變化，H2O2組細(xì)胞增殖倍數(shù)明顯降低 (P<0.01)；哈巴苷處理細(xì)胞4 d后，與H2O2組比較，H2O2+哈巴苷組細(xì)胞增殖倍數(shù)明顯升高(P<0.05)，表明哈巴苷能減弱H2O2對心肌細(xì)胞增殖的抑制作用。詳見圖2。

與H9c2組比較，*P0.01；與H2O2組比較，#P0.05圖2 哈巴苷對心肌細(xì)胞增殖的影響

2.2 哈巴苷對心肌細(xì)胞凋亡的影響 與H9c2組比較，哈巴苷組細(xì)胞凋亡率無明顯變化，H2O2組細(xì)胞凋亡率明顯升高 (P< 0.05)；與H2O2組比較， H2O2+ 哈巴苷組細(xì)胞凋亡率顯著降低 (P< 0.05)，表明哈巴苷能抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。詳見圖3。

2.3 哈巴苷對凋亡蛋白表達(dá)的影響 與H9c2組比較，H2O2組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低(P< 0.05)，Bax表達(dá)水平明顯升高 (P< 0.05)；與H2O2組比較，H2O2+ 哈巴苷組細(xì)胞Bcl-2表達(dá)明顯增多，Bax表達(dá)顯著減少 (P< 0.05)。詳見圖4。H2O2還能顯著促進(jìn)H9c2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Caspase-9的表達(dá) (P< 0.05)，能顯著減弱H2O2誘導(dǎo)Caspase-3和Caspase-9表達(dá)的作用 (P<0.05)，表明哈巴苷能對抗H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。詳見圖5。

2.4 哈巴苷對氧化應(yīng)激的影響 H2O2組H9c2細(xì)胞的DCF熒光強度與H9c2組比較明顯升高 (P<0.05)，表明H2O2能誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生；H2O2+ 哈巴苷組細(xì)胞DCF熒光強度明顯低于H2O2組 (P<0.05)，表明哈巴苷能減弱H2O2誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生的作用。與H9c2組比較，哈巴苷組細(xì)胞上清液SOD、MDA和GSH的含量無明顯變化，H2O2組細(xì)胞上清液SOD和GSH的濃度明顯降低 (P< 0.05)，MDA濃度明顯升高 (P< 0.05)；H2O2+ 哈巴苷組細(xì)胞上清液SOD和GSH含量與H2O2組比較顯著升高 (P< 0.05)，MDA濃度明顯降低 (P< 0.05)，提示哈巴苷能抑制H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡。詳見圖6、圖7。

3 討 論

既往研究認(rèn)為，細(xì)胞壞死是心肌損傷的主要方式，但近年來研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡也是心肌細(xì)胞損傷的另一主要方式[9]。大量研究發(fā)現(xiàn)，心臟病病人心肌受損的中心區(qū)域和周圍組織均出現(xiàn)了大量的心肌細(xì)胞凋亡，表明心肌凋亡也是導(dǎo)致心肌梗死的主要原因之

一[10]。因此，抑制心肌細(xì)胞凋亡是治療心血管疾病的關(guān)鍵。近年來研究表明，多類中藥提取物都具有心肌保護(hù)作用。蛇床子提取物蛇床子素能抑制阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[11]，川芎提取物能通過抑制心肌細(xì)胞凋亡提高心力衰竭大鼠的心臟功能[12]。哈巴苷是白毛夏枯草的主要活性成分，能通過促進(jìn)GSH表達(dá)，抑制一氧化氮的分泌抑制神經(jīng)元細(xì)胞氧化應(yīng)激，減少神經(jīng)元的凋亡[8]，但其對心肌細(xì)胞的作用還未見報道。

H2O2是一類ROS，常被用于誘導(dǎo)心肌缺血和心肌缺血再灌注等心血管疾病模型[13]。研究表明，ROS可通過抑制Bcl-2表達(dá)，并促進(jìn)Bax轉(zhuǎn)移至線粒體誘導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放，從而上調(diào)Caspase家族蛋白的表達(dá)，啟動線粒體細(xì)胞凋亡程序[13]。Caspase家族蛋白是細(xì)胞凋亡的最終執(zhí)行者，其中Caspase-3和Caspase-9是細(xì)胞凋亡的最重要調(diào)控分子[14]。因此，本研究采用H2O2處理心肌H9c2細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，H2O2能顯著抑制心肌細(xì)胞增殖并能促進(jìn)心肌細(xì)胞H9c2凋亡，誘導(dǎo)Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)。哈巴苷具有顯著減弱H2O2抑制心肌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的作用，并能抑制Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)。此外，H2O2還能明顯上調(diào)H9c2細(xì)胞Bax的表達(dá)水平，降低Bcl-2的表達(dá)水平，哈巴苷能顯著減弱H2O2對Bcl-2和Bax表達(dá)的調(diào)控作用，提示哈巴苷能對抗H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

與H9c2組比較，*P 0.05；與H2O2組比較，#P 0.05圖3 哈巴苷對心肌細(xì)胞H9c2凋亡的影響

與H9c2組比較，*P<0.05；與H2O2組比較，#P<0.05圖4 哈巴苷對Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

與H9c2組比較，*P 0.05；與H2O2組比較，#P 0.05圖5 哈巴苷對H9c2細(xì)胞Caspase-3和Caspase-9表達(dá)的影響

與H9c2組比較，*P0.05與H2O2組比較，#P 0.05圖6 哈巴苷對ROS表達(dá)的影響

與H9c2組比較，*P 0.05；與H2O2組比較，#P 0.05圖7 哈巴苷對H9c2細(xì)胞SOD、GSH和MDA分泌的影響

氧化應(yīng)激損傷是導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡的主要原因之一。在慢性心力衰竭、心肌缺血等許多心血管疾病中均會出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷[15]。ROS是誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的主要活性分子，主要由線粒體分泌產(chǎn)生[16]。ROS可直接導(dǎo)致線粒體膜破壞，使線粒體膜通透性增加，出現(xiàn)水腫，直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡程序的啟動[17]。同時ROS還能抑制抗氧化酶的產(chǎn)生。已有研究表明，ROS直接導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡和壞死[18]。因此，有效地抑制氧化應(yīng)激將有利于心血管疾病的治療。H2O2能通過促進(jìn)線粒體細(xì)胞色素C的釋放誘導(dǎo)凋亡基因的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[2]。本研究采用DCF-DA法檢測了H9c2細(xì)胞內(nèi)ROS活性，實驗結(jié)果表明，H2O2作用于H9c2細(xì)胞能顯著提高細(xì)胞內(nèi)ROS的活性，提示H2O2能誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激。哈巴苷能顯著減弱H2O2對ROS活性的誘導(dǎo)作用，提示哈巴苷具有一定的抗氧化損傷活性。MDA是典型的細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，與細(xì)胞損傷程度呈正相關(guān)；SOD是一類抗氧化酶，GSH是人體內(nèi)重要的還原劑，兩者均能清除細(xì)胞內(nèi)的ROS，從而減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2能顯著抑制抗氧化酶SOD和還原酶GSH分泌，促進(jìn)MDA的分泌，進(jìn)一步表明H2O2能誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激，哈巴苷能顯著降低細(xì)胞上清液中MDA濃度，升高SOD和GSH濃度，同時還能抑制ROS的產(chǎn)生，表明哈巴苷具有抗心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的能力，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，哈巴苷能抑制H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率，降低凋亡相關(guān)蛋白Bax、Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)水平，并能促進(jìn)凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)，同時還能升高細(xì)胞上清液中SOD和GSH的濃度，降低MDA濃度并抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的活性，表明哈巴苷能通過抑制氧化應(yīng)激抑制心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。本研究探究了哈巴苷對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的作用，以期為心血管疾病的治療提供新的潛力藥物依據(jù)。