鄭曉聰，陳 雨，溫智清，葉文濤，張建勛，黃倩君，梁曉清，劉 葒*

(1.深圳海關(guān)食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東深圳518045；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇南京210095；3.大連海洋大學(xué)，遼寧大連116023；4.杭州眾測(cè)生物科技有限公司，浙江杭州310052)

鯉浮腫病毒(Carp edema virus，CEV)是鯉浮腫病(Carp edema virus disease，CEVD)的病原[1]，常致使鯉或錦鯉出現(xiàn)昏睡、浮腫、爛鰓、凹眼等臨床癥狀，引起較高的死亡率[2]。CEV是DNA病毒，大小200 nm，具囊膜，屬于痘病毒科(Poxviridae)[3]。CEV呈全球性流行，現(xiàn)已在我國(guó)河北、河南、遼寧、北京、浙江、云南等多個(gè)省市檢出CEV[4-7]。

鯉是我國(guó)主要的淡水養(yǎng)殖品種之一，錦鯉為鯉的變種，是重要的觀賞魚(yú)養(yǎng)殖品種，開(kāi)展鯉浮腫病防控技術(shù)研究對(duì)該魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)具有重要的意義。建立靈敏、高效的病原檢測(cè)技術(shù)是目前水生動(dòng)物疫病防控的有效手段之一。目前，CEV的檢測(cè)方法有組織電鏡、套式PCR和熒光定量PCR方法[1,8-9]，其中英國(guó)環(huán)境漁業(yè)水產(chǎn)養(yǎng)殖研究中心(CEFAS)建立的熒光定量PCR方法適用于我國(guó)CEV的監(jiān)測(cè)[1,10]。重組酶介導(dǎo)的鏈替換擴(kuò)增(Recombinase-aid amplification，RAA)技術(shù)是一種恒溫快速擴(kuò)增核酸的方法。利用重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA聚合酶代替了傳統(tǒng)PCR的熱循環(huán)解鏈過(guò)程，實(shí)現(xiàn)了在37℃～42℃恒溫下的核酸快速擴(kuò)增，其中熒光RAA技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)20 min內(nèi)實(shí)時(shí)觀察檢測(cè)結(jié)果，具備簡(jiǎn)單、節(jié)能、便攜、快速等特點(diǎn)[11-12]，特別適合基層實(shí)驗(yàn)室使用以及用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。鑒于現(xiàn)有的檢測(cè)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備依賴(lài)性，為此，本研究應(yīng)用了一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)--RAA用于CEV檢測(cè)，為CEV的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)提供新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 病毒株與臨床樣品 CEV、錦鯉皰疹病毒(Koi herpesvirus，KHV)、鯉皰疹病毒 2型(Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2)、傳染性脾腎壞死病毒(Infection spleen and kidney necrosis virus，ISKNV)、流行性造血器官壞死病毒(Epizootic haematopoietic necrosis virus，EHNV)、鯉春病毒血癥病毒(Spring viremia of carp virus，SVCV)、傳染性鮭魚(yú)貧血病毒(Infectious salmon anaemia virus，ISAV)、病毒性出血性敗血癥病毒(Viral hemorrhagic septicemia virus，VHSV)、傳染性造血器官壞死病病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV)、傳染性胰腺壞死病病毒(Infectious pancreatic necrosis virus， IPNV)、 草 魚(yú) 出 血病病毒(Grass carp hemorrhage virus，GCHV)等魚(yú)類(lèi)病毒均由深圳海關(guān)食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心水生動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室保存。35份鯉科魚(yú)類(lèi)臨床樣品為各省市送檢樣品。

1.2 主要試劑與儀器 RAA核酸擴(kuò)增試劑(熒光型)購(gòu)自杭州眾測(cè)生物科技有限公司；TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit、 PCR kit、Real time PCR Kit、pMD18-T載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；QIAamp DNA Mini QIAcube Kit購(gòu)自QIAGEN公司；核酸自動(dòng)提取儀(QIAcube)購(gòu)自QIAGEN公司；恒溫?zé)晒庑盘?hào)收集裝置T16-ISO購(gòu)自英國(guó)Twista公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與篩選 根據(jù)GenBank登錄的CEV基因序列(MG550022.1、KX253997.1、KX254006.1、KX254012.1、KX254027.1、KX254003.1、KX254013.1、KX254020.1)進(jìn)行比對(duì)分析，設(shè)計(jì)3組引物和探針(表1)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。將3組引物按照熒光RAA反應(yīng)體系對(duì)提取的CEV基因組進(jìn)行擴(kuò)增，篩選反應(yīng)速度快、熒光信號(hào)強(qiáng)的引物組進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表1 RAA的引物和探針Table 1 Primers and probes for CEV fluorescence RAA assay

1.4 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建與鑒定 根據(jù)CEV P4a基因序列(MG550022.1)設(shè)計(jì)一對(duì)引物(CEVcF：TTG TAGTTGTTTAATATTTGTG/CEVcR：TTCCAGAGC AAGTTAAAATTGC)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以提取的CEV基因組DNA為模板，使用該引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增的基因片段純化后連接pMD18-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-CEVP4a，重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定正確后，測(cè)定濃度并計(jì)算拷貝數(shù)，作為熒光RAA的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

1.5 RAA反應(yīng)條件的優(yōu)化 采用篩選的引物探針，將其濃度分別配制為 5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L按照RAA(熒光型)試劑盒說(shuō)明書(shū)配制50 μL反應(yīng)體系，置于T16-ISO儀器中反應(yīng)進(jìn)行引物探針濃度篩選。確定引物探針濃度后，選取濃度2.8×103拷貝/μL和2.8×101拷貝/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，在不同溫度(37℃、39℃、42℃)條件下反應(yīng)20 min，收集FAM熒光。以確定最佳反應(yīng)條件。

1.6 特異性試驗(yàn) 按照核酸提取試劑盒說(shuō)明提取CEV、 KHV、 CyHV-2、 ISKNV、 EHNV、 SVCV、ISAV、VHSV、IHNV、IPNV、GCHV等魚(yú)類(lèi)病毒核酸，其中提取的SVCV、ISAV、VHSV、IHNV、IPNV、GCHV的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以建立的CEV熒光RAA方法進(jìn)行擴(kuò)增，以CEV病毒核酸作為陽(yáng)性對(duì)照，評(píng)估該方法的特異性。

1.7 敏感性性試驗(yàn) 將構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍倍比稀釋(2.8×106拷貝 /μL～2.8×100拷貝 /μL)后，分別作為模板，以建立的CEV熒光RAA方法進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)ddH2O為陰性對(duì)照，確定該方法的敏感性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 選取 2.8×106拷貝 /μL、2.8×104拷貝 /μL、2.8×102拷貝 /μL 3 個(gè)濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，每個(gè)濃度重復(fù)5次，根據(jù)起峰時(shí)間計(jì)算組內(nèi)變異系數(shù)；同時(shí)，將上述試驗(yàn)每3 d檢測(cè)一次，連續(xù)檢測(cè)3次，根據(jù)起峰時(shí)間計(jì)算組間變異系數(shù)，以評(píng)價(jià)該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.9 臨床樣品的檢測(cè) 使用35份臨床鯉科魚(yú)類(lèi)樣品對(duì)建立的方法進(jìn)行測(cè)試，每份樣品包含每尾魚(yú)的腦、脾、腎、腮等病料，根據(jù)徐立蒲[5]報(bào)道的方法處理各病料樣品。使用試劑盒提取樣品核酸，應(yīng)用本研究建立的CEV熒光RAA方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)應(yīng)用熒光定量PCR方法[1]進(jìn)行檢測(cè)，比較二者的檢測(cè)結(jié)果，并計(jì)算二者的符合率。

2 結(jié)果

2.1 引物的篩選 用設(shè)計(jì)的3組引物和探針，分別對(duì)CEV基因組核酸進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示第1組引物探針在擴(kuò)增4 min時(shí)開(kāi)始檢測(cè)到熒光信號(hào)，并且熒光信號(hào)較強(qiáng)，擴(kuò)增效果最好(圖1)，因此選擇第一組引物探針用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果 通過(guò)熒光信號(hào)和擴(kuò)增曲線(xiàn)起峰時(shí)間來(lái)選擇最優(yōu)引物探針濃度，當(dāng)引物和探針濃度均為10 μmol/L時(shí)，熒光信號(hào)最強(qiáng)，擴(kuò)增曲線(xiàn)出現(xiàn)得最早，將其確定為最佳工作濃度。對(duì)反應(yīng)溫度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示，以不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板時(shí)均顯示反應(yīng)溫度為37℃時(shí)，最終達(dá)到的熒光信號(hào)值較強(qiáng)，但是起峰時(shí)間較晚，反應(yīng)溫度為42℃時(shí)，起峰較快，但是熒光信號(hào)值較低。反應(yīng)溫度為39℃時(shí)，反應(yīng)相對(duì)迅速，信號(hào)值強(qiáng)，因此選擇39℃作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)條件。

最終確定反應(yīng)體系與條件為：濃度為10 μmol/L的引物CEVRPAF1和CEVRPAR1各2μL，10μmol/L的探針 CEV RPA P1 0.6 μL，模板 1 μL，A Buffer 40.9 μL，ddH2O 1 μL。將上述 47.5 μL 溶液混合均勻后加入到裝有凍干酶制劑的反應(yīng)管中，上下翻轉(zhuǎn)混勻，最后加入2.5 μL B buffer(280 mmol/L醋酸鎂)后立即置于T16-ISO儀器中39℃反應(yīng)20 min。

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果 提取幾種常見(jiàn)魚(yú)類(lèi)病毒的核酸作為模板，應(yīng)用建立的熒光RAA方法進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示除CEV外，其它病毒核酸均無(wú)擴(kuò)增(圖2)，表明該方法特異性較強(qiáng)。

2.4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定正確后命名為pMD18-CEVP4a。重組質(zhì)粒堿基數(shù)為3 039 bp，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)得核酸濃度為9.32 ng/μL，計(jì)算得到質(zhì)粒為2.8×109拷貝/μL，將構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按 10倍倍比稀釋?zhuān)x取2.8×106拷貝 /μL～2.8×100拷貝/μL濃度的質(zhì)粒作為模板進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，該方法對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)下限為2.8×101拷貝/μL(圖3)，表明該方法的敏感性較高。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 選取了3個(gè)濃度的CEV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于5%(表2)，表明建立的實(shí)時(shí)熒光RAA方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

圖2 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Specificity test of the fluorescence RAA assay

圖3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Sensitivity test of the fluorescence RAA assay

表2 實(shí)時(shí)熒光RAA的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Reproducibility assay of the fluorescence RAA assay

2.6 臨床樣品檢測(cè) 應(yīng)用本研究建立的熒光RAA方法以及文獻(xiàn)報(bào)道的熒光定量PCR方法對(duì)35份鯉科魚(yú)類(lèi)樣品分別進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，7個(gè)樣品顯示為CEV陽(yáng)性，熒光RAA方法與熒光定量PCR結(jié)果一致。表明本研究建立的方法準(zhǔn)確性較高，可以用于對(duì)鯉科魚(yú)類(lèi)臨床樣品CEV的檢測(cè)。

3 討論

鯉和錦鯉的養(yǎng)殖具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，2017年徐立蒲等對(duì)我國(guó)北方9個(gè)省市97家鯉和錦鯉養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行了隨機(jī)監(jiān)測(cè)，顯示CEV檢出率高達(dá)52%，提示CEV已經(jīng)成為對(duì)我國(guó)鯉和錦鯉養(yǎng)殖業(yè)危害最重要的病原之一[5]。目前，尚無(wú)對(duì)CEV的有效治療措施，因此建立一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，有利于盡早切斷病原傳播，降低經(jīng)濟(jì)損失。

熒光RAA是一種新型的目前比較成熟可靠的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)[12]。其包含一對(duì)擴(kuò)增引物和一條探針，引物和探針與熒光定量PCR的不同，引物長(zhǎng)度通常是30 nt～35 nt，探針46 nt～52 nt，探針中含有一個(gè)堿基類(lèi)似物四氫呋喃(THF)，并在其兩側(cè)連接dT-熒光基團(tuán)和對(duì)應(yīng)的dT-淬滅基團(tuán)，在3'端連接一個(gè)阻斷基團(tuán)(如C3-spacer)[11,13]。目前尚無(wú)專(zhuān)門(mén)的程序用于設(shè)計(jì)RAA引物探針，因此設(shè)計(jì)的引物通常需要篩選，本研究對(duì)設(shè)計(jì)的3組引物探針經(jīng)篩選得到一組擴(kuò)增效率較好的引物探針。除了引物以外，溫度與熒光信號(hào)值也常作為熒光RAA的篩選條件。在本實(shí)驗(yàn)中，提高溫度至42℃可以加快反應(yīng)速度，但是會(huì)影響熒光信號(hào)峰值，而在37℃條件下反應(yīng)速度則相對(duì)較慢，反應(yīng)15 min后仍未到達(dá)擴(kuò)增平臺(tái)期。另外，熒光RAA結(jié)果判斷依賴(lài)于擴(kuò)增曲線(xiàn)，通常情況下，反應(yīng)15 min就足夠反映擴(kuò)增趨勢(shì)，但是核酸濃度較低時(shí)，擴(kuò)增曲線(xiàn)起峰時(shí)間較晚，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間有助于熒光信號(hào)的增加，因此本研究最后選用39℃20 min作為反應(yīng)條件，一方面有利于快速反應(yīng)，另一方面是為了保證充足的反應(yīng)時(shí)間反映擴(kuò)增結(jié)果。

RAA技術(shù)避免了迅速升降反應(yīng)溫度的弊端，降低了儀器設(shè)備的復(fù)雜性，在條件簡(jiǎn)陋的地區(qū)，僅用簡(jiǎn)單的恒溫裝置即可完成反應(yīng)，其次，RAA所用的試劑一般為無(wú)需低溫保存的凍干粉末，保證了其在運(yùn)輸和保存過(guò)程中的穩(wěn)定性，降低了保存成本，非常適合于養(yǎng)殖場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。本研究方法對(duì)35份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與熒光定量PCR方法[1]結(jié)果一致，表明了該方法的實(shí)用性較強(qiáng)。綜上，本研究建立的CEV熒光RAA檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高，為CEV的檢測(cè)提供了一種新型的技術(shù)手段。