孔令明，禚振男，郭 平，曲昌寶，王子靜，劉丹丹，陶建平，許金俊*

(1.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚州225009；2.江蘇動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州225009；3.諸城市畜牧獸醫(yī)局，山東諸城262200)

組織滴蟲病又稱“盲腸肝炎”或“黑頭病”，是由火雞組織滴蟲(Histomonas meleagridis)引起的雞形目禽類的一種原蟲病，以肝臟壞死、盲腸腫大和排硫磺樣糞便為主要特征，在火雞群中引起較高的發(fā)病率和死亡率[1]。該病的傳播需要雞異刺線蟲的參與，禽類也可以通過泄殖腔直接接觸病原而感染，肝臟和盲腸是火雞組織滴蟲的主要靶器官[1]。該病在雞群中感染流行情況也十分嚴(yán)重，在我國很多地區(qū)均有不同程度的發(fā)生，部分養(yǎng)殖場由于禽舍嚴(yán)重污染，常導(dǎo)致該病暴發(fā)，死亡率達(dá)到20%～30%，對養(yǎng)雞業(yè)的危害很大[2]。因此，開展組織滴蟲病的研究，對于保障養(yǎng)殖業(yè)的健康快速發(fā)展具有重要的意義。

先前研究結(jié)果表明，火雞組織滴蟲可以感染除靶器官以外的禽類其它臟器如心臟、肺臟、腸道和法氏囊等，但結(jié)果不盡一致。這些差異與所采用的檢測方法的敏感性有一定的關(guān)系，且均僅為感染后某個時間點的蟲體分布情況[3-5]。探究蟲體經(jīng)人工感染后在禽類體內(nèi)的動態(tài)分布規(guī)律，對于該病的臨床診治以及藥物和疫苗的研發(fā)至關(guān)重要，目前相關(guān)的研究僅在火雞上有過報道[6]。黃羽肉雞在我國華東及南方地區(qū)的飼養(yǎng)范圍廣、數(shù)量多，組織滴蟲病發(fā)病率較高[2]，本研究對15日齡蘇禽黃羽肉雞泄殖腔感染火雞組織滴蟲JSYZ-A株，通過PCR技術(shù)對感染蟲體后雞體內(nèi)的火雞組織滴蟲動態(tài)分布進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步探究組織滴蟲病的致病機(jī)理、開展藥物和疫苗的研制奠定了一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲株及實驗動物 火雞組織滴蟲JSYZ-A株為本實驗室從江蘇省揚州市儀征市某草雞飼養(yǎng)場暴發(fā)組織滴蟲病的病雞肝臟中分離，凍存于液氮，復(fù)蘇后在含90%M199、10%馬血清、11 mg米粉(每10 mL培養(yǎng)液添加量)的培養(yǎng)液中40℃厭氧傳代培養(yǎng)；1日齡蘇禽黃羽肉雞100只，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所育種中心，出殼后即飼喂在嚴(yán)格消毒的適宜環(huán)境中，供給充足的水和飼料，飼料和水中未添加任何藥物。

1.2 主要試劑 Medium 199(1×)、滅活馬血清購自美國Gibco公司；米粉購自美國Sigma-Aldrich公司；臺盼藍(lán)染液購自北京索萊寶科技有限公司；DL2000 DNA Marker、LATaqDNA聚合酶購自TaKaRa公司；dNTP mix購自生工生物工程(上海)有限公司；含火雞組織滴蟲18S rRNA基因的陽性質(zhì)粒pGEM-T-Easy-HM 18S rRNA由本實驗室構(gòu)建并保存。

1.3 人工感染試驗 對傳代培養(yǎng)2 d的火雞組織滴蟲JSYZ-A株經(jīng)臺盼藍(lán)染色后計數(shù)，調(diào)整濃度到105個/mL，吸取1 mL培養(yǎng)液分裝到1.5 mL EP管中，3 000 r/min離心5 min，棄上清，將沉淀輕輕吹勻，放入40℃恒溫培養(yǎng)箱中保存?zhèn)溆?。?5日齡蘇禽黃羽肉雞分為兩組，其中70只經(jīng)泄殖腔接種蟲體105個/羽作為感染組，30只接種培養(yǎng)基作為陰性對照。

1.4 組織樣品的采集 感染后定期觀察雞群臨床癥狀并做記錄。感染后第1 d開始每隔3 d迫殺5只感染組肉雞，同時每次迫殺2只對照肉雞，觀察其大體病理變化，采集其腦、心臟、肺臟、脾臟、法氏囊、肝臟、胰臟、腺胃、十二指腸、空腸、盲腸、直腸等組織器官。分別取0.2 g的組織器官樣品于高壓滅菌的EP管凍存。

1.5 黃羽肉雞組織臟器內(nèi)蟲體的PCR檢測 采用酚-氯仿-異戊醇方法常規(guī)提取肉雞組織樣品DNA。按照參考文獻(xiàn)[7]設(shè)計火雞組織滴蟲18S rRNA基因引物：F1：5'-GAAAGCATCTATCAAGTG GAA-3'/F2： 5'-GATCTTTTCAAATTAGCTTTAAA-3'，引物由北京六合華大基因公司合成。對提取的組織DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以pGEM-T-Easy-HM 18S rRNA為模板作為陽性對照。25 μL反應(yīng)體系包括：10×PCR Buffer 2.50 μL，10 mol/L dNTPs 2.00 μL，10 μmol/L F1 和 F2 各 2.00 μL，50 ng/μL LATaq DNA 聚合酶 0.25 μL，50 ng/μL DNA 模板 5.00 μL，ddH2O 11.25 μL；反應(yīng)條件為：95℃ 2 min；95℃35 s、57℃35 s、72℃45 s，40個循環(huán)；72℃5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 臨床癥狀觀察 黃羽肉雞接種火雞組織滴蟲后，感染組和對照組雞均未出現(xiàn)死亡。但感染組雞出現(xiàn)精神沉郁，食欲減退，縮頭垂翅(圖1A)、被毛蓬亂無光澤、呆立或聚堆，拉稀、黃綠色稀粥狀糞便、惡臭，飲水量增加，癥狀在第7 d左右開始出現(xiàn)，第16 d左右最為明顯，而后逐漸恢復(fù)正常。對照組未見異常癥狀。表明人工感染獲得成功。

2.2 剖檢病變觀察 黃羽肉雞感染火雞組織滴蟲3 d時肝臟呈現(xiàn)輕微腫脹，后出現(xiàn)不明顯白色壞死點，隨著時間延長，肝臟上白色壞死點數(shù)量增多，單個病灶聚集融合成較大的病變，感染后13 d～16 d左右出現(xiàn)中央凹陷且邊稍緣隆起的黃白色壞死灶(圖1B)，而后逐漸恢復(fù)正常。盲腸感染蟲體3 d時開始腫大，盲腸壁出血，盲腸內(nèi)有黃色的散發(fā)臭味的液體，盲腸黏膜呈現(xiàn)彌漫性出血、壞死和潰瘍，盲腸壁增厚明顯，盲腸內(nèi)形成典型干酪樣栓塞，與黏膜粘連，不易剝離(圖1C)，感染后13 d～16 d時最為典型，而后逐漸恢復(fù)正常。其它臟器和對照組所有臟器均未見異常眼觀病變(圖1D、1E)。表明黃羽肉雞人工感染火雞組織蟲后主要引起雞肝臟和盲腸的損傷。

圖1 感染火雞組織滴蟲發(fā)病黃羽肉雞的臨床表現(xiàn)和大體病理變化Fig.1 Clinical symptoms and pathological charges of yellow feather broilers infected withH.meleagridis

2.3 黃羽肉雞組織臟器的PCR檢測結(jié)果 黃羽肉雞經(jīng)泄殖腔感染火雞組織滴蟲后定期采集其不同組織臟器樣品，提取DNA進(jìn)行蟲體特異性基因PCR檢測。結(jié)果顯示，感染蟲體后4 d，部分雞的盲腸和肝臟中檢測到蟲體特異性基因，盲腸在感染后13 d檢出率最高達(dá)到100%，22 d后其檢出率降低，一直持續(xù)到34 d還能檢測到；肝臟的檢出率在感染后16 d時達(dá)到最高100%，之后的檢出率同盲腸類似；十二指腸、直腸和脾臟在感染后10 d～22 d時檢測到蟲體特異性基因；腺胃和空腸、心臟均在感染后13 d～19 d檢測到蟲體特異性基因；肺臟在感染后19 d檢測到蟲體DNA；胰腺、腦、腎臟和睪丸組織在整個實驗過程中并未檢測到蟲體特異性基因(圖2)；對照組雞所有臟器不同時間點檢測結(jié)果均為陰性。蟲體詳細(xì)動態(tài)分布結(jié)果見表1。表明火雞組織滴蟲主要靶器官為盲腸和肝臟，也會侵害其它一些臟器，但持續(xù)時間較短。

圖2 黃羽肉雞感染火雞組織滴蟲后部分臟器組織蟲體18S rRNA基因PCR檢測結(jié)果Fig.2 Amplification of 18S rRNA in different organs in the yellow feather broilers infected withH.meleagridis

關(guān)于火雞組織滴蟲人工感染后蟲體在禽體內(nèi)的動態(tài)分布，目前僅見于火雞。Huber等通過PCR檢測了火雞組織滴蟲感染火雞19 d內(nèi)每隔3 d體內(nèi)臟器的分布情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝臟、盲腸、十二指腸、空-回腸、直腸、腺胃和法氏囊均檢測到火雞組織滴蟲，肝臟、盲腸存在時間最長，同時脾、肺和腦等組織也檢測到了火雞組織滴蟲，在腎臟和胰臟中并未發(fā)現(xiàn)火雞組織滴蟲[6]。本研究中蟲體存在時間最長的是盲腸和肝臟，腺胃、十二指腸、直腸、空腸、心臟和脾臟中間時間或能夠檢測到蟲體，1周左右，肺臟呈現(xiàn)一過性感染，胰腺、腦、腎臟和睪丸組織未檢測到蟲體。本次臟器蟲體DNA的監(jiān)測時間長達(dá)34 d，雖然結(jié)果與火雞基本一致，但不同時間點除靶器官以外在其余臟器的分布還是存在一定的差異，這與所采用的檢測方法的敏感性和人工感染后取材的時間點不同有一定的關(guān)系[3-5]。與此同時，由于禽類品種的差異，火雞比雞更為易感，感染后誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)的不同，均會導(dǎo)致臟器蟲體的動態(tài)分布出現(xiàn)一定的差別[5,8]。另外，雞的不同品系間的易感性也存在一定差異，如蛋雞比肉雞更為易感[9]，伊莎蛋雞比羅曼蛋雞更為易感[10]，不同地方品系雞易感性的差異及人工感染后蟲體的動態(tài)分布規(guī)律，將是我們下一步研究的重點。

表1 人工感染后黃羽肉雞體內(nèi)各臟器不同時間點蟲體PCR檢測結(jié)果Table 1 Dynamic distribution ofH.meleagridisin the yellow feather broilers postinfection

本研究首次系統(tǒng)地闡明了火雞組織滴蟲感染黃羽肉雞后組織器官內(nèi)蟲體的動態(tài)分布情況，建立了雞感染模型，可以應(yīng)用于不同蟲株的毒力測定、疫苗的攻蟲保護(hù)效果評價等研究，也為深入解析火雞組織滴蟲的致病機(jī)理及其防治提供了依據(jù)。