左智敏，康洪濤，吳紅霞，祖少坡，田 進，劉永相，倪宏波，曲連東*

(1.黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江大慶163319；2.中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150069)

貓杯狀病毒病(Feline caliciviral disease，F(xiàn)CVD)又稱貓傳染性鼻結膜炎，是一種由貓杯狀病毒(Feline calicivirus，F(xiàn)CV)感染引起的貓科動物口腔和上呼吸道感染的高發(fā)傳染病。該病在臨床上主要表現(xiàn)為鼻炎、結膜炎和口腔潰瘍，有時可以導致支氣管炎、肺炎及慢性口腔潰瘍，個別會出現(xiàn)關節(jié)或肌肉疼痛[1-2]，是嚴重危害寵物、經濟動物和野生動物健康的重要疫病。

FCV F9株于上世紀50年代被分離[3]，是FCV的原始疫苗株，也是大多數(shù)FCV活疫苗的親本株，被普遍用于FCV疫苗方面的研究[4]。最近Afonso等[5]對歐洲多國的FCV流行病學調查結果顯示，目前FCV F9株仍然能夠誘導機體產生具有廣譜中和效應的抗體[5]，F(xiàn)CV F9株應當作為歐洲地區(qū)FCV疫苗接種的首選。本研究采用分段克隆的方法，將FCV F9株的全基因組分3段擴增并依次克隆至pOK-12載體中，經序列替換，獲得嵌合FCV F9株的全基因組克隆，并拯救出病毒。本研究首次構建出嵌合FCV F9株的感染性克隆，以期為FCV新型疫苗的研發(fā)奠定基礎，也為FCV致病機理和免疫機制的研究提供技術平臺。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 FCV F9株、pOK-12載體、已構建出的嵌合FCV強毒株的感染性克隆質粒pOK-2280[6]和貓腎細胞(F81)由中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所自然疫源性人獸共患病團隊保存并提供。病毒RNA/DNA提取試劑盒、質粒提取試劑盒以及膠回收試劑盒購自AXYGEN公司；限制性內切酶、CloneJET試劑盒、T4 DNA連接酶、反轉錄試劑盒、轉染試劑LipofectamineTMMessengerMAXTMTransfection Reagent購自Thermo公司；DNA Marker、體外轉錄試劑盒 HiScribeTMT7以及 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒購自NEB公司；Ribom 7G Cap Analog試劑盒購自Promega公司。

1.2 引物的設計與合成 根據FCV F9株基因序列(AB643784.1)設計相關的引物(表1)，并由吉林庫美生物科技有限公司合成。

1.3 pOK-12載體的改造 將人工合成的含XhoⅠ-KpnⅠ-SacⅠ-SalⅠ-PstⅠ-NotⅠ的寡核苷酸 pOK-linker-F與pOK-linker-R等摩爾比混合，通過94℃變性10 min，55℃復性20 min，獲得具有粘性末端的雙鏈DNA。將雙鏈DNA純化后與經XhoⅠ和NotⅠ酶切的pOK-12質粒連接，獲得的重組質粒經測序鑒定正確后命名為pOK-LK。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in the study

1.4 嵌合FCV F9株全長基因組重組質粒的構建按照試劑盒的使用說明提取FCV F9的病毒基因組RNA，反轉錄為cDNA，并以該cDNA為模板進行下述PCR擴增。

以引物T7F9-F/F9-R1 PCR擴增F9-T7G1片段，經純化后用CloneJET試劑盒連接到pJET1.2中，獲得 pJET-F9-T7G1。SalⅠ和 SacⅠ酶切 pJET-F9-T7G1獲得F9-T7G1片段并克隆到pOK-LK中，獲得pOKF9-T7G1。

以引物F9-F2/F9-R2擴增F9G2片段，經純化后連接到pJET1.2中，獲得pJET-F9G2，SacⅠ和PstⅠ酶切pJET-F9G2，回收F9G2片段，插入到pOK-F9-T7G1中，獲得pOK-F9-T7G1G2。

將文獻[6]中引物 Hdr1-F、Hdr2-R、Hdr3-F、Hdr4-R等摩爾比混合，94℃變性10 min、55℃復性20 min，獲得產物HDRZ。以引物F9-F3/F9-R3擴增F9G3片段。以F9G3和HDRZ為模板，通過引物F9-F3/Hdr4-R擴增F9G3-HDRZ片段，純化后連接至pJET1.2中，獲得pJET-F9G3-HDRZ。將其經PstⅠ和NotⅠ酶切后克隆到pOK-F9-T7G1G2中，獲得pOK-F9-F，并對質粒經測序鑒定。

1.5 嵌合FCV全長基因組感染性克隆pOK-F9H的構建與鑒定 為將pOK-F9-F的1823位前段區(qū)域(1685～1940)替換為pOK-2280相應區(qū)域，進行了下列操作：分別以質粒pOK-F9-F和pOK-2280為模板，以引物Hid-F/1685-R和1685f/28sacR PCR擴增2280-F9A片段(1 115～1 684)和2280-F9B片段(1 685～1 940)，并以Hid-F/28sacR為引物，對2280-F9A片段和2280-F9B片段進行融合PCR擴增，獲得2280-F9的融合片段(1 115～1 940)。

將2280-F9片段中出現(xiàn)差異的5個氨基酸位點突變成FCV F9對應的氨基酸。以2280-F9為模板，引物2280-F9-F1/2280-F9-R1 PCR擴增產物A；以2280-F9為模板，以引物2280-F9-F4/2280-F9-R4 PCR擴增產物K；以產物A和K為模板，以引物2280-F9-F1/2280-F9-R4 PCR擴增產物B；以2280-F9為模板，引物2280-F9-F2/2280-F9-R3 PCR擴增產物C；以2280-F9為模板，以引物2280-F9-F3/1820r PCR擴增產物D；以產物C和D為模板，以引物2280-F9-F2/1820-R PCR擴增產物F；以產物B和F為模板，引物2280-F9-F1/1820-R PCR擴增產物H1；以2280-F9為模板，以引物1820F/F9-R1 PCR擴增產物H2；以產物H1和H2為模板，以引物2280-F9-F1/F9-R1 PCR擴增產物2280-F9H；2280-F9H片段的氨基酸序列與FCV F9完全相同。以HindⅢ和SacⅠ酶切2280-F9H替換pOK-F9-F相應序列，最終得到嵌合質粒 pOK-F9H。經 SalⅠ和 NotⅠ雙酶切鑒定pOK-F9H質粒，并對質粒全長測序鑒定。

1.6 嵌合病毒rFCV F9的拯救 將重組質粒pOK-F9H以NotⅠ酶切線性化，體外轉錄、RNA加帽和回收后，根據文獻[7]方法轉染F81細胞中進行病毒拯救。將轉染后制備的病毒液接種新的F81細胞，當細胞出現(xiàn)50%CPE時，收取上清液，命名為rFCV F9的P1代病毒。連續(xù)傳代至P10代，根據試劑盒的使用說明提取rFCV F9 P10代病毒與親本病毒的基因組，反轉錄為cDNA，以引物F9-F1/F9-R1擴增FCV F9-G1片段和rFCV F9-G1片段并對PCR產物測序鑒定。

1.7 嵌合rFCV F9的蝕斑和細胞病變(CPE)形成試驗 將拯救病毒與親本病毒分別按照MOI 0.01分別接種于密度為100%的六孔板中的F81細胞中。病毒吸附1 h后棄掉病毒液，無血清DMEM沖洗兩遍，將2%的低熔點瓊脂糖與2×DMEM混合后以3 mL/孔鋪于六孔板，置于37℃培養(yǎng)36 h后，用4%甲醇固定細胞2 h，結晶紫染色15 min，觀察兩種病毒蝕斑的大小及形態(tài)。

同時，將拯救病毒與親本病毒分別按照MOI 0.001感染處于對數(shù)生長期的24孔板中的F81細胞。經上述步驟處理后，置37℃培養(yǎng)36 h后在顯微鏡下觀察兩種病毒CPE的形成情況。

1.8 嵌合rFCV F9多步生長曲線的測定 將拯救病毒與親本病毒按照MOI 0.001分別感染處于對數(shù)生長期的24孔板中的F81細胞，分別在感染后的12 h、24 h、36 h和48 h收獲病毒，采用文獻[6]中方法測定收獲病毒的病毒滴度，每個時間點重復測定3次，繪制病毒的多步生長曲線。

2 結果與討論

2.1 pOK-12載體的改造結果 將具有粘性末端的雙鏈DNA純化后與經 XhoⅠ和 NotⅠ酶切的pOK-12質粒連接，測序結果顯示，獲得了插入酶切位點的重組質粒pOK-LK。

2.2 FCV F9株全基因組的拼接 以FCV F9的cDNA為模板，經PCR擴增獲得的F9-T7G1、F9G2、F9G3-HDRZ片段大小分別為2.8 kb、2.8 kb、2 kb(圖1)，依次插入到改造后的載體pOK-LK中，重組質粒命名為pOK-F9-F。測序結果顯示，質粒pOK-F9-F的1823位堿基出現(xiàn)移碼突變，其余基因序列與親本病毒完全相同。

2.3 嵌合FCV全長基因組感染性克隆的構建 經測序pOK-F9-F第1823位基因出現(xiàn)移碼突變，所以將pOK-F9-F的1823位前段替換為pOK-2280相應區(qū)域。分別以質粒pOK-F9-F和pOK-2280為模板，分別經PCR擴增出2280-F9A片段和2280-F9B片段并融合，獲得2280-F9融合片段。將2280-F9片段中與FCV F9存在差異的5個氨基酸位點依次突變?yōu)镕CV F9的氨基酸，獲得2280-F9H片段。將2280-F9H片段通過HindⅢ和SacⅠ雙酶切替換至質粒pOK-F9-F中的相應部分，獲得嵌合無突變的FCV F9全基因組序列的質粒pOK-F9H。經SalⅠ和NotⅠ雙酶切pOK-F9H(載體2.1 kb，插入片段8 kb)，鑒定，結果與預期相符(圖1)，測序結果無突變。表明構建了嵌合FCV F9株全基因組序列的重組質粒。

本研究中構建的pOK-F9-F質粒第1823位基因增加了一個堿基T，產生移碼突變。盡管嘗試了多種方式重新構建，但該突變仍然存在。為構建出FCV F9感染性克隆，本研究將pOK-F9-F的1685～1940位基因序列替換為pOK-2280[6]的相應序列，并將前者基因組推導的氨基酸差異位點依次突變?yōu)镕9株相應位置的同義密碼子。替換后獲得具有同義密碼子的嵌合FCV F9全基因組的重組質粒pOK-F9H。

圖1 目的片段的擴增及重組質粒pOK-F9H的雙酶切鑒定Fig.1 Amplification of target genes and identification of recombinant plasmid pOK-F9H using double enzyme digestion

2.4 嵌合rFCV F9病毒的拯救 將體外轉錄制備的pOK-F9H的加帽RNA轉染F81細胞，24 h后出現(xiàn)典型的CPE，未轉染細胞無變化。將轉染后制備的病毒液接種新的F81細胞，當細胞出現(xiàn)50%CPE時，收獲上清液(P1代)，將P1代病毒連續(xù)傳至P10代后仍然有CPE產生，表明獲得了可以穩(wěn)定傳代的病毒。

進一步對親本病毒和獲得的P10代拯救病毒分別進行PCR擴增，分別獲得FCV F9-G1片段和rFCV F9-G1片段。測序結果顯示該兩個片斷雖然堿基序列存在差異，但推導出的氨基酸序列相同。

2.5 嵌合rFCV F9的蝕斑和CPE形成試驗結果接種F81細胞后，拯救病毒和親本病毒均可以產生明顯蝕斑，且形成的蝕斑大小和形態(tài)基本一致(圖2)；兩株病毒感染F81細胞后產生的CPE基本一致(圖2)。以上結果表明拯救病毒與親本病毒具有相似的噬斑形成能力和相似的CPE形成能力。

2.6 嵌合rFCV F9的多步生長曲線測定 繪制的病毒多步生長曲線結果顯示，rFCV F9和FCV F9的體外多步生長生長曲線基本一致(圖3)，表明rFCV F9與FCV F9具有相似的體外生長能力。推測，F(xiàn)CV的生物學特性可能僅由氨基酸序列決定，堿基序列不對病毒生物學特性產生影響；pOK-F9轉化到細菌中后影響了細菌的增殖，推測FCV F9的堿基序列在細菌增殖時可能發(fā)揮某些未知的阻礙作用。

后續(xù)將會探究FCV基因組各蛋白的生物學特性，了解病毒蛋白在其生命活動周期中發(fā)揮的功能，為FCV基因的功能提供新的理解。

圖2 拯救病毒和親本病毒感染F81細胞后形成的蝕斑和CPEFig.2 Plaques and CPE compare F81 cells infected with virus after 36 h

圖3 rFCV F9和親本株FCV F9的多步生長曲線Fig.3 Multi-step growth curve of rFCV F9 and FCV F9