王 殷 尹會(huì)偉 陳 龍 羅施中 姜建輝

（1新疆兵團(tuán)南疆化工資源利用工程實(shí)驗(yàn)室/塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300）（2北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京市朝陽(yáng)區(qū) 100029）

蜂蜜中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分［1,2］，其中，糖類占75%,其它還包括蛋白質(zhì)、維生素、有機(jī)酸、微量元素等［3］。蜂蜜中的各種成分協(xié)同作用，賦予了蜂蜜抗菌、抗氧化、促進(jìn)傷口愈合、延緩細(xì)胞衰老等多種活性［4］。

天然蜂蜜可視為糖的飽和水溶液，呈現(xiàn)酸性，這種高糖高滲和酸性的特征是蜂蜜抗菌活性的基礎(chǔ)［4］。此外，蜂蜜中還含有許多抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的酶，如：溶菌酶、抗氧化酶等，同時(shí)還含有許多來(lái)自蜜源植物的抗菌物質(zhì)［5］。研究表明，麥盧卡蜂蜜的抗菌能力相較于其他蜂蜜更好，其原因可能是麥盧卡蜂蜜中丙酮醛的含量較高［6］。另外，研究人員對(duì)桉樹(shù)蜜、紫云英蜜等7種蜂蜜進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)桉樹(shù)蜜對(duì)幽門螺桿菌的抑制作用最強(qiáng)，這可能是由于其中黃酮含量較高所致［7］。

蜂蜜還含有豐富的礦物質(zhì)、多肽和酚酸，這些成分賦予了蜂蜜良好的抗氧化活性［8］。酚酸類物質(zhì)與蜂蜜的抗氧化作用相關(guān)性最高，因?yàn)榉铀嵊幸种苼喯趸淖饔茫瑫r(shí)能夠增加血漿中抗氧化物的含量［9］，另外，蜂蜜中含有的過(guò)氧化氫酶也具有抗氧化自由基的作用。此外，蜂蜜中的礦物質(zhì)含量與人體礦物質(zhì)含量基本相似，因此極易被人體吸收，這些礦物質(zhì)可以在抗氧化過(guò)程中作為電子供體，與蛋白質(zhì)、酚酸共同作用，從而使得蜂蜜的抗氧化活性大大增強(qiáng)［4］。Escuredo等人研究比較了山花蜜、石楠蜜、甘露蜜等5種蜂蜜的抗氧化作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)石楠蜜中酚酸含量最高，但甘露蜜和栗子蜜中含有的蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)與酚酸共同產(chǎn)生了協(xié)同作用，因而抗氧化活性高于石楠蜜［10］。

蜂蜜的主要分類依據(jù)是蜜源的種類，并以此為出發(fā)點(diǎn)推測(cè)蜂蜜功效，例如：市面上常見(jiàn)的紫云英蜜，清熱解毒，潤(rùn)燥補(bǔ)中；槐花蜜可降血壓，涼血止血等等。新疆伊犁尼勒克地區(qū)植被豐茂，盛產(chǎn)百花蜜。當(dāng)?shù)厣交òㄞ挂虏?、牛至、百里香、突厥益母草、西域黨參、甘草、柳蘭、一枝黃等近二百種野生蜜源植物，因此可能賦予百花蜜更多的功效。然而，蜂蜜的釀造過(guò)程與蜜蜂本身存在密不可分的關(guān)系［11］，不同蜂種所釀的同種蜂蜜可能存在成分和功效的不同。因此，本文對(duì)新疆伊犁州新源縣、尼勒克縣地區(qū)的三種主要蜂種所釀的百花蜜的主要成分進(jìn)行比較，并分析可能存在的功能差異，為更好地開(kāi)發(fā)和利用蜂種資源提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用的新疆黑蜂蜂蜜、中華蜜蜂蜂蜜、喀爾巴阡蜂蜂蜜由伊犁紅郡蜂業(yè)有限責(zé)任公司負(fù)責(zé)采集，為這三個(gè)蜂種釀造的百花蜜，采自新疆伊犁州新源縣、尼勒克縣山區(qū)的山花，采集時(shí)間為2015年7-8月。取蜜后，將蜂蜜在4℃保存于密閉容器中。

主要試劑：氫氧化鈉、酚酞、碘、碘化鉀、亞鐵氰化鉀、醋酸鋅、堿性酒石酸銅溶液、濃硫酸、蔗糖、苯酚、連苯三酚、碳酸鈉、福林酚試劑、亞硝酸鈉、蘆丁、亞硝酸鋁、考馬斯亮藍(lán)、牛血清蛋白均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Multiskan Spectrum全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀,Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 蜂蜜基本質(zhì)量參數(shù)檢測(cè)

根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》中對(duì)蜂蜜所規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)［12］對(duì)三種蜂蜜的各項(xiàng)質(zhì)量參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，包括糖度、酸度、淀粉和糊精、5-羥甲基糠醛含量、還原糖含量五項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

蜂蜜的糖度使用糖度計(jì)測(cè)定。

蜂蜜的酸度測(cè)定采用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液滴定法，以酚酞作為終點(diǎn)指示劑。計(jì)算滴定100 g樣品相當(dāng)于加入1 N（當(dāng)量）氫氧化鈉溶液的毫升數(shù)。

淀粉和糊精的檢測(cè)根據(jù)藥典規(guī)定，采用碘液顯色方法，不得顯藍(lán)色、綠色或紅褐色。

5-羥甲基糠醛含量檢測(cè)采用UV法。將樣品與亞鐵氰化鉀和醋酸鋅反應(yīng)，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)溶液在284 nm和336 nm處吸光度的差值。藥典規(guī)定其差值不可超過(guò)0.34。

還原糖含量采用酒石酸銅滴定法進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2 可溶性糖含量測(cè)定［13］

可溶性糖含量采用硫酸苯酚法進(jìn)行測(cè)定。取一定量的三種蜂蜜樣品溶于蒸餾水中，煮沸30 min，將提取液稀釋定容，搖勻后向試管中先加入1 mL 9%的苯酚溶液，混合搖勻后再向其中緩緩加入5 mL濃硫酸，在室溫條件下靜置30 min，測(cè)定485 nm波長(zhǎng)處的吸光度。配制100μg/mL蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液，稀釋配制不同濃度的蔗糖溶液，按照上述方法測(cè)定溶液吸光度值，制作蔗糖標(biāo)準(zhǔn)曲線用于計(jì)算蜂蜜樣品中的可溶性糖含量。

1.3.3 總酚酸含量測(cè)定［14］

蜂蜜中總酚酸含量的測(cè)定采用Folin-Ciocucalteu比色法。取三種蜂蜜樣品各1 g左右，加入50%乙醇10 mL，超聲提取30 min，提取液經(jīng)稀釋定容后，取0.10 mL置于試管中。向每支試管中加入95%乙醇至0.5 mL，再向其中加入0.25 mol/L福林酚試劑0.5 mL，靜置30 min后加入1 mL 15%NaCO3，繼續(xù)靜置30 min后，將試管內(nèi)液體移至5 mL離心管中，3 500 r/min離心3 min，取上清液測(cè)定其在760 nm波長(zhǎng)的吸光度。配制0.2 mg/mL連苯三酚標(biāo)準(zhǔn)液，稀釋配制不同濃度的連苯三酚溶液，按照上述方法測(cè)定溶液吸光度值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用于計(jì)算蜂蜜樣品中的酚酸含量。

1.3.4 黃酮含量測(cè)定［15-17］

蜂蜜中總黃酮的含量采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法測(cè)定。稱取三種蜂蜜各25 g于錐形瓶中，加入無(wú)水乙醇25 mL，常溫下超聲萃取30 min，重復(fù)3次，合并三次萃取所得上清液，旋干，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，作為樣品溶液。取0.3 mL樣品溶液，加0.32 mL水，搖勻后加入0.08 mL 50 g/L亞硝酸鈉溶液，搖勻后靜置6 min，加入100 g/L硝酸鋁溶液0.08 mL，搖勻后靜置6 min，再加人40 g/L氫氧化鈉0.80 mL，加水稀釋至2 mL，搖勻，靜置15 min，檢測(cè)510 nm波長(zhǎng)下的吸光度。配制10 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，稀釋配制不同濃度的蘆丁溶液，按照上述方法測(cè)定溶液的吸光度值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用于計(jì)算蜂蜜樣品中的黃酮含量。

1.3.5 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

蜂蜜中的蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定。取三種蜂蜜精確配制40 mg/mL溶液，在試管中加入1.0 mL蜂蜜溶液，并加入5 mL考馬斯亮藍(lán)染液，搖勻后測(cè)定595 nm波長(zhǎng)的吸光度。配制1 mg/mL牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，稀釋配制同濃度的牛血清蛋白溶液，按照上述方法測(cè)定溶液的吸光度值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用于計(jì)算蜂蜜樣品中的蛋白質(zhì)含量。

1.3.6 淀粉酶活性測(cè)定［18］

稱取三種蜂蜜樣品各10 g，加入50 mL蒸餾水溶解，置于40℃水浴鍋中放置1 h。隨后向三種蜂蜜溶液中滴加1滴酚酞指示劑，用0.05 mol/L氫氧化鈉中和至呈現(xiàn)淺粉色。轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加入蒸餾水稀釋至刻度。取4支試管，分別加入3.0 mL、2.3 mL、1.8 mL、1.4 mL上述蜂蜜溶液，加入蒸餾水至5 mL。震蕩搖勻后分別加入0.02 mol/L乙酸溶液、0.1 mol/L氯化鈉溶液各0.5 mL，震蕩搖勻，加入1%淀粉溶液2.5 mL。再次震蕩搖勻后，立即將所有試管浸入40℃水浴中放置1 h，取出后立即放入沸水浴中煮沸。取出后在每一個(gè)試管中滴加1滴碘液，觀察各試管顏色。此時(shí)試管顏色呈現(xiàn)黃色、紫紅色、藍(lán)色三種，根據(jù)紫紅色管號(hào)數(shù)查得淀粉酶值。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種蜂蜜的基本質(zhì)量參數(shù)

用糖度儀測(cè)定三種蜂蜜的波美度，結(jié)果顯示三種蜂蜜的波美度均高于37.0，其中新疆黑蜂蜂蜜的波美度最高，達(dá)到40.4，而喀爾巴阡蜂蜂蜜的波美度最低，僅為37.0（表1）。一般認(rèn)為，天然蜂蜜經(jīng)過(guò)采集后需釀造至少7天，使含水量降低至20%以下，稱為成熟蜜。糖度測(cè)試結(jié)果顯示，這三種蜂蜜均未達(dá)到成熟蜜標(biāo)準(zhǔn)，可能是蜂農(nóng)取蜜的時(shí)間較短所致。但是，仍然可以看出新疆黑蜂蜂蜜的波美度明顯高于其它兩種蜂蜜（P＜0.05）。

三種蜂蜜中新疆黑蜂蜂蜜的酸度最低，而中華蜜蜂蜂蜜和喀爾巴阡蜂蜂蜜的酸度相差不多，酸度明顯高于新疆黑蜂蜂蜜（P＜0.05）（表1）。酸度主要是由于葡萄糖降解產(chǎn)生。中華蜜蜂蜂蜜和喀爾巴阡蜂蜂蜜的糖度較低，說(shuō)明其含水量較高，這使葡萄糖更容易降解，因此產(chǎn)生較高的酸度。

三種蜂蜜依法檢測(cè)均不顯藍(lán)色、綠色或紅褐色。根據(jù)此實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以判斷這三種蜂蜜中幾乎不含淀粉和糊精（表1）。

根據(jù)藥典規(guī)定方法檢測(cè)，三種蜂蜜中的5-羥甲基糠醛均未超標(biāo)（表1）。

三種蜂蜜的還原糖含量檢測(cè)結(jié)果與糖度檢測(cè)的結(jié)果基本一致，其中新疆黑蜂蜂蜜中還原糖含量最高，達(dá)到80.3%，明顯高于其它兩種蜂蜜（P＜0.05）（表1）。三種蜂蜜的還原糖含量均高于藥典規(guī)定的≥64.0%的要求。

表1 三種蜂蜜基本質(zhì)量的測(cè)定結(jié)果

綜上所述，三種蜜蜂所產(chǎn)的百花蜜基本合格，但是新疆黑蜂蜂蜜的質(zhì)量明顯優(yōu)于其它兩種蜂蜜。

2.2 主要化學(xué)成分檢測(cè)

2.2.1 可溶性糖含量

采用硫酸苯酚法測(cè)定可溶性糖含量，結(jié)果顯示新疆黑蜂蜂蜜中的可溶性糖含量最高，達(dá)到51.86%，而中華蜜蜂蜜的可溶性糖含量次之，喀爾巴阡蜂蜂蜜的可溶性糖含量最低（圖1）。結(jié)合前述測(cè)定的糖度和還原性糖結(jié)果，三者在三種蜂蜜中的含量趨勢(shì)基本一致，且在新疆黑蜂蜂蜜中的含量最高。

圖1 三種蜂蜜中可溶性糖含量

圖2 (A)三種蜂蜜中的總酚酸含量；（B）三種蜂蜜中的總黃酮含量。＊P＜0.05

2.2.2總酚酸和黃酮含量

文獻(xiàn)中報(bào)道［16,17］，大部分蜂蜜中酚酸含量在0.133-1.485 mg/g，本實(shí)驗(yàn)中所測(cè)得的酚酸含量，新疆黑蜂蜂蜜為1.035±0.021 mg/g，中華蜜蜂蜂蜜為1.180±0.014 mg/g，喀爾巴阡蜂蜂蜜則在0.935±0.007 mg/g（圖2A）。三種蜂蜜中的酚酸含量均有顯著性差異（P＜0.05）。

黃酮也是蜂蜜中一種重要成分，主要來(lái)源于植物的花粉、花蜜和蜂膠。三種蜂蜜中，新疆黑蜂蜂蜜的總黃酮含量最高，達(dá)到13.2±0.3μg/g，是其它兩種蜂蜜黃酮含量的兩倍多（P＜0.05）（圖2B）。

2.2.3 總蛋白含量及淀粉酶活性

蜂蜜中的蛋白質(zhì)主要來(lái)自蜜蜂的分泌，也是能夠反映三個(gè)蜂種所釀蜂蜜差異的重要指標(biāo)。從結(jié)果中可以看出，新疆黑蜂蜂蜜中蛋白質(zhì)含量遠(yuǎn)低于另外兩種蜂蜜（P＜0.05），而中華蜜蜂蜂蜜和喀爾巴阡蜂蜂蜜中蛋白質(zhì)含量相差不大（P＞0.05）（圖3）。

圖3 三種蜂蜜中的蛋白含量＊P＜0.05

蜂蜜中的淀粉酶采用比色法并根據(jù)顯色情況查對(duì)照表確定。新疆黑蜂蜂蜜和中華蜜蜂蜂蜜中淀粉酶值均為8.3，而喀爾巴阡蜂蜂蜜中的淀粉酶值高于另外兩種蜂蜜，為13.9。

3 討論

根據(jù)2010版《中華人民共和國(guó)藥典》中對(duì)中華蜜蜂蜂蜜所規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)［12］對(duì)三種蜂蜜的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。綜合考慮［19,20］，新疆黑蜂蜂蜜不僅符合各項(xiàng)指標(biāo)而且質(zhì)量較優(yōu)，且含糖量最高。中華蜜蜂蜂蜜與喀爾巴阡蜂蜂蜜的各項(xiàng)指標(biāo)基本相似，但中華蜜蜂蜂蜜中還原糖含量更高，相較于喀爾巴阡蜂蜂蜜也具有更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

三種蜂蜜的糖度、還原糖含量、可溶性糖含量的差異具有一致的趨勢(shì)，在新疆黑蜂蜂蜜中最高，在喀爾巴阡蜂蜂蜜中最低。黃酮和酚酸都屬于多酚類化合物，在蜂蜜中的含量?jī)H次于糖，這些化合物與蜂蜜的抗氧化活性呈正相關(guān)［21,22］。曹煒［22］等人測(cè)定了槐花蜜、黃芪蜜、蘋果蜜、蕎麥蜜、枸杞蜜、山楂蜜、山花蜜、五味子蜜、菊花蜜和油菜蜜等十種蜂蜜的總酚酸含量和抗氧化活性。結(jié)果表明,十種蜂蜜的總酚酸含量在13.30±0.92 mg/100 g蜂蜜至148.46±2.34 mg/100 g蜂蜜之間。本文所研究的三種山花蜜的酚酸含量沒(méi)有特別明顯的差異，但均處于較高水平，提示三種蜂蜜可能都有較好的抗氧化能力。新疆黑蜂蜂蜜中黃酮的含量是另外兩種蜂蜜的二倍多，這提示新疆黑蜂蜂蜜可能具有較好的抗炎、抗菌等功效。蜂蜜中的蛋白質(zhì)，特別是多種人體所需的酶類，主要來(lái)自蜜蜂釀蜜過(guò)程中混入的蜜蜂唾液分泌物。而酶的活性也常作為評(píng)價(jià)蜂蜜新鮮程度的一個(gè)指標(biāo)。三種蜂蜜中新疆黑蜂蜂蜜的蛋白含量相對(duì)較低，但是淀粉酶活性與中華蜜蜂蜂蜜相當(dāng)；而喀爾巴阡蜂蜂蜜中的蛋白含量和酶活都相對(duì)較高。

綜上，結(jié)果顯示新疆黑蜂蜂蜜的多項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于中華蜜蜂蜂蜜和喀爾巴阡蜂蜂蜜。新疆黑蜂是新疆伊犁地區(qū)特有的蜜蜂品種，適應(yīng)當(dāng)?shù)氐淖匀画h(huán)境條件，具有較強(qiáng)的采蜜、抗病和抗災(zāi)能力，這可能也是其蜂蜜質(zhì)量?jī)?yōu)于其它兩種蜂蜜的主要原因。不同蜂種釀制的蜂蜜主要成分存在一定的差異，這可能與蜜蜂的活動(dòng)能力及本身的分泌物質(zhì)有關(guān)，導(dǎo)致所產(chǎn)的蜂蜜在功效上出現(xiàn)一定的差異。本研究為不同蜂種所產(chǎn)的百花蜜的比較提供了一定的參考。除蜜源植物造成的蜂蜜品質(zhì)的差異外，也可考慮不同蜂種采集釀制的作用，從而更深入地了解蜂蜜的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生物學(xué)功能。