史秋蘭 何 旺 白紅進(jìn)

（塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院／新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點實驗室，新疆阿拉爾843300）

黃芪多糖作為黃芪的主要有效成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗菌、降血壓、降血糖、肝腎保護(hù)等多種藥理作用［1］。黃芪多糖因其來源廣泛、資源豐厚、成本價廉，易得且毒副作用小，因此受到重視。近年來，對黃芪多糖的研究領(lǐng)域有所拓寬，逐漸采用不同改性方法對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，并研究各種改性產(chǎn)物對機(jī)體影響機(jī)制及其量效關(guān)系，并在抗炎、抗氧化、免疫等方面做出了有益的探索［2-4］。

研究表明，鐵是人體必需的微量元素之一［5-9］，當(dāng)體內(nèi)缺乏鐵時，就會導(dǎo)致缺鐵或缺鐵性貧血。目前亞鐵鹽已被臨床用于治療缺鐵性貧血，但由于其穩(wěn)定性差，極易被氧化成三價鐵鹽從而對消化道刺激作用顯著，且不易被機(jī)體吸收，因此，很少有人可以持續(xù)服用，尤其是幼兒。國內(nèi)外的研究表明，多糖鐵（III）復(fù)合物作為一種新型補(bǔ)鐵劑，不僅具有多糖的生物活性，對胃腸道刺激作用不大。此外當(dāng)其釋放鐵時，它可以被身體有效吸收和利用，產(chǎn)生毒性較小的副作用。因此，多糖鐵作為一種具有良好配位穩(wěn)定性的新型補(bǔ)鐵劑［10］已成為近年來研究的熱點。目前，研究領(lǐng)域中存在多種多糖鐵復(fù)合物，如玉米多糖鐵、黨參多糖鐵［11］、當(dāng)歸多糖鐵、枸杞多糖鐵［12］等。

本實驗以黃芪多糖和氯化鐵為原料合成黃芪多糖鐵（Ⅲ）復(fù)合物，將多糖與鐵元素有機(jī)結(jié)合起來同時具有雙重生物活性，而且減少了對腸胃刺激、副作用小，有利于肌體吸收。利用紫外-可見光譜、紅外光譜兩種表征手段對其進(jìn)行表征，并用通過DPPH清除能力、ABTS清除能力、OH清除能力和還原力測定APS-Fe的抗氧化能力，為黃芪多糖鐵的后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 實驗材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：黃芪多糖購自于成都埃法科技有限公司（大于95%），儲存于2-8℃冰箱中

試劑：DPPH、ABTS購自于成都埃法科技有限公司。鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000 ug/mL）、三氯化鐵、檸檬酸鈉、抗壞血酸、氫氧化鈉、無水乙醇、磷酸二氫鉀、鄰二氮菲、七水合硫酸亞鐵、30%雙氧水、氯化鈉、磷酸氫二鈉、過硫酸鉀、鐵氰化鉀和三氯乙酸均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；SHA-C數(shù)顯水浴恒溫振蕩器（金壇華峰科技有限公司）；UV-752N型紫外/可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；DZ-2BC真空干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；Thermo iCAP 7000等離子體發(fā)射光譜儀（賽默飛世爾儀器有限公司）；ZF-A型紫外透射反射分析儀（上海驥輝科學(xué)分析儀器有限公司）；Nicolet 380（K）傅立葉紅外光譜分析儀（日本島津）；PHS-3C pH計（儀電科學(xué)儀器）。

2 實驗方法

2.1 黃芪多糖鐵（Ⅲ）復(fù)合物的制備

參考王花［13］等的方法，精確稱量2 g黃芪多糖，0.5 g檸檬酸鈉放入帶塞錐形瓶中，用60 mL蒸餾水溶解，將恒溫水浴振蕩器調(diào)節(jié)至70℃并連續(xù)振蕩，同時緩慢加入2 mol/L氯化鐵溶液和20%氫氧化鈉溶液，用pH計調(diào)節(jié)溶液的pH為8.0～8.5，當(dāng)溶液中出現(xiàn)沉淀時，立即停止滴加氯化鐵和氫氧化鈉，繼續(xù)在恒溫水浴中搖動1 h，取出反應(yīng)液并冷卻至室溫，然后以3000 r/min離心10 min，將上清液倒入燒杯中，加入約3倍量無水乙醇，并將混合物在4℃冰箱中放置過夜，完全沉淀。將沉淀物溶于純凈水，將溶液置于透析袋中并用流水透析過夜，再用去離子水透析過夜。將透析袋（MW3500）中溶液倒入燒杯中，用無水乙醇洗滌2次，洗液合并。再用3倍體積無水乙醇完全沉淀，將沉淀放入60℃恒溫真空干燥箱中干燥至恒重固體，得到黃芪多糖鐵（Ⅲ）復(fù)合物。

2.2 鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)李玉賢［14］的方法，取7個50 mL容量瓶，分別加入10 ug/mL鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液0，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL，然后加入10%鹽酸羥胺1.0 mL，鄰菲羅啉顯色液2.5 mL和5.0 mL醋酸鈉（pH=4.5緩沖液），用蒸餾水稀釋至刻度，放置10 min，以試劑溶液為空白在510 nm處測定吸光度，吸光度為縱坐標(biāo)。

圖1 鐵的標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖1所示，鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=0.2085x+0.0012，相關(guān)系數(shù)為0.9999?；跇悠啡芤旱奈舛龋删€性方程計算出樣品的鐵含量。

2.3 樣品中鐵含量的測定

稱取0.018 9 g黃芪多糖鐵（Ⅲ）樣品，并稀釋定容至50 mL容量瓶。從樣品溶液中分別吸取溶液2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL，依次加入10%鹽酸羥胺1.0 mL，鄰菲羅啉顯色液2.5 mL和5.0 mL醋酸鈉（pH=4.5）緩沖液，蒸餾水稀釋、定容，搖勻，放置10 min，在510 nm處以試劑溶液為空白，測吸光度。

稱取0.016 9 g黃芪多糖鐵樣品，加入10 mL濃硝酸及0.5 mL高氯酸，蓋上漏斗，浸泡2.5 h，消化至溶液呈透明或淡黃色液體，定容至10 mL容量瓶，通過等離子體發(fā)射光譜儀測定其鐵含量。

2.4 結(jié)構(gòu)表征

將黃芪多糖和黃芪多糖鐵（Ⅲ）用去離子水配成0.1 mg/mL的溶液，參比溶液為去離子水，在波長200～400 nm范圍內(nèi)用紫外光譜掃描。

將少量的黃芪多糖和黃芪多糖鐵（Ⅲ）粉末用KBr壓片，使用傅里葉紅外光譜進(jìn)行紅外光譜測定，測定范圍為500～4 000 cm-1。

2.5 黃芪多糖鐵（Ⅲ）水溶液穩(wěn)定性測試

將適量的多糖鐵溶于水，以亞鐵氰化鉀檢驗其水溶液，若未生成血紅色溶液，證明多糖鐵水溶液中不存在游離的Fe3+。

2.6 抗氧化活性測定

2.6.1 對羥自由基（·OH）的清除作用

準(zhǔn)確吸取鄰二氮菲溶液1.0 mL（1.5 mmol/L），依次加入0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.4）2.0 mL和1.0 mL樣品溶液，充搖勻，加入1.0 mL硫酸亞鐵溶液（0.2 mol/L），混勻，加入1.0 mL 0.10%過氧化氫溶液，搖勻，置于恒溫水浴（37℃）中1 h，測量波長510 nm處吸光度AS；以1.0 mL超純水代替1.0 mL過氧化氫溶液來測定吸光度Ab。以黃芪多糖和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品作陽性對照，按以上步驟操作，分別計算清除率。

OH清除率(%)=As/Ab×100

2.6.2對DPPH自由基的清除作用

準(zhǔn)確地將不同濃度的黃芪多糖鐵（Ⅲ）溶液吸取至試管中，加入 2.0 mLDPPH溶液（0.2 mmol/L），混勻，在室溫下避光30 min，用無水乙醇在517 nm處調(diào)零并測定吸光度A1；精確移取不同濃度的黃芪多糖鐵（Ⅲ）溶液于試管中，加入2.0 mL無水乙醇溶液，充分反應(yīng)，室溫下避光反應(yīng)30 min，于517 nm處測定吸光度A2；取2.0 mLDPPH溶液，加入2.0 mL無水乙醇溶液，室溫下避光反應(yīng)30 min，于517 nm處測定吸光度A0。以黃芪多糖和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品做陽性對照組，并按照以上步驟同時操作，分別計算清除率。

DPPH自由基清除率（%）=［1-（A1-A2/A0）］×100%

2.6.3對ABTS自由基的清除作用

精確移取0.89 mL過硫酸鉀溶液（140 mmol/L）加入到50 mL ABTS自由基溶液（7 mmol/L）中，放置過夜，4℃下保存，制備成ABTS儲備液。在實驗之前將ABTS儲備液恢復(fù)至室溫，并將儲備液稀釋至在734 nm處具有0.70±0.02的吸光度，制成ABTS工作液。將0.2 mL不同濃度的樣品溶液加入到3.8 mL ABTS工作液中，混合均勻，避光處理6 min，在734 nm處測定吸光值。以黃芪多糖和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品作陽性對照，按以上步驟操作，分別計算清除率。

2.6.4 對總還原力的測定

移取1.0 mL不同濃度的黃芪多糖鐵（Ⅲ）溶液，分別加入1.5 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.4）和1.5 mL 10%鐵氰化鉀溶液，充分搖勻，在50℃水浴反應(yīng)20 min,，冰袋迅速冷卻，再加入10%的三氯乙酸溶液1.5 mL，以3000 r/min速度離心10 min，小心吸取上清液3.0 mL，并加入蒸餾水3.0 mL和0.5 mL的三氯化鐵溶液，充分反應(yīng)，靜置10 min，于700 nm處測定吸光度。每組試驗平行測定3次，并以黃芪多糖和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品按照上述相同步驟操作，做陽性對照組。

3 結(jié)果與討論

3.1 黃芪多糖鐵（Ⅲ）復(fù)合物的制備

稱取黃芪多糖2.005 1 g，得到黃芪多糖鐵復(fù)合物0.570 3 g，所得產(chǎn)率為28.44%。黃芪多糖中鐵的含量為0.007 0 mg/g，合成的黃芪多糖鐵復(fù)合物為紅褐色顆粒，經(jīng)鄰菲啰啉紫外分光光度法測定其鐵含量為57.36 mg/g，ICP等離子體發(fā)射法測定鐵含量為53.95 mg/g。復(fù)合后鐵含量增加了，說明鐵復(fù)合成功。

3.2 黃芪多糖鐵（Ⅲ）復(fù)合物的紫外光譜法表征結(jié)果

圖2 紫外光譜

由圖2可知，三氯化鐵、黃芪多糖鐵無明顯吸收峰。APS樣品在275 nm處有吸收峰，說明APS中含有羰基結(jié)構(gòu)，而APS-Fe樣品中的吸收峰消失。吸收峰的明顯變化，顯示了化合物結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，說明APS中的羰基與Fe3+發(fā)生反應(yīng)，生成APS-Fe。

3.3 黃芪多糖鐵（Ⅲ）復(fù)合物的紅外光譜法表征結(jié)果

圖3 紅外光譜

由圖3可知，黃芪多糖鐵和黃芪多糖紅外吸收圖譜未發(fā)生明顯變化，說明在多糖在與鐵螯合后多糖結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯改變。對比黃芪多糖鐵和三氯化鐵譜圖發(fā)現(xiàn)黃芪多糖鐵在1 606 cm-1、1 585 cm-1的特征吸收峰消失。從黃芪多糖與黃芪多糖鐵（Ⅲ）復(fù)合物兩者的IR圖譜吸收峰的位置來看，在多糖與鐵配位后，多糖鐵在3 406 cm-1處的O-H伸縮振動吸收峰藍(lán)移至3 428 cm-1處且峰形變鈍，說明多糖的羥基參與了絡(luò)合反應(yīng)。3 400 cm-1為O-H伸縮振動，2 920 cm-1處吸收縫為C-H伸縮振動，1 640 cm-1處吸收峰為C=O吸收峰，1450-1300 cm-1間的寬吸收峰C-H彎曲振動，1150-1050 cm-1間的三組吸收峰為C-O伸縮振動和C-O-C吸收。黃芪多糖鐵在600cm-1處出現(xiàn)一個特征吸收峰，根據(jù)文獻(xiàn)分析為FeOOH特征吸收峰，說明黃芪多糖鐵中鐵核具有聚合的類似FeOOH結(jié)構(gòu)。

3.4 水溶液穩(wěn)定性測試結(jié)果

用亞鐵氰化鉀檢驗黃芪多糖鐵（Ⅲ）水溶液，未生成血紅色溶液，則證明APS-Fe水溶液中不含游離的Fe3+。

3.5 抗氧化活性測試結(jié)果

3.5.1 對羥自由基（·OH）的清除作用

圖4 對羥自由基（·OH）的清除作用

從圖4可以看出，APS-Fe和APS對羥自由基的清除作用稍有差異，且清除作用均隨著濃度的增長而增強(qiáng)。清除羥基自由基的次序為：蘆?。続PSFe＞APS。在APS-Fe的質(zhì)量濃度為1 mg/mL時，其對羥自由基的清除率為65.83%。根據(jù)擬合方程，黃芪多糖的IC50值為0.418 3 mg/mL，黃芪多糖鐵的IC50值為0.355 9 mg/mL。一般認(rèn)為IC50值低于10 mg/mL則該種物質(zhì)具有較好的抗氧化活性，因此說明APS-Fe仍具有較好的羥自由基（·OH）清除活性。

3.5.2 對DPPH自由基的清除作用

圖5 對DPPH自由基的清除作用

由圖5可知，APS-Fe和APS對DPPH具有一定的清除能力，隨著濃度的增加，對DPPH的清除效果越好，這兩者均呈現(xiàn)出量效關(guān)系。清除DPPH自由基的順序為：蘆丁＞APS＞APS-Fe。

3.5.3 對ABTS自由基的清除作用

圖6 對ABTS自由基的清除作用

由圖6可知，隨著濃度的增大APS和APS-Fe對ABTS自由基的清除作用變化比較緩慢，在較高質(zhì)量濃度下，對ABTS自由基具有一定的清除能力，且這兩者對ABTS自由基的清除活性顯著低于蘆丁。清除ABTS自由基的順序為：蘆?。続PS＞APS-Fe。

3.5.4 對總還原力的測定

圖7 對總還原力的測定結(jié)果

由圖7可以看出，黃芪多糖鐵（Ⅲ）和黃芪多糖的總還原力相近，均具有一定的還原能力，還原能力隨著溶液濃度的升高而增大。在0.02-1.00 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，蘆丁具有明顯的還原能力，蘆丁的還原能力明顯強(qiáng)于黃芪多糖鐵（Ⅲ）和黃芪多糖的還原能力。

4 結(jié)論與討論

本實驗在弱堿性條件下，以氯化鐵和APS為原料，合成制備穩(wěn)定的黃芪多糖鐵（Ⅲ）復(fù)合物，產(chǎn)率為28.44%，通過鄰菲羅啉紫外分光光度法和ICP等離子體發(fā)射法測定黃芪多糖鐵（Ⅲ）復(fù)合物中鐵含量分別57.36 mg/g和53.95 mg/g。

采用紫外-可見光譜、紅外光譜兩種波譜學(xué)手段對鐵復(fù)合物進(jìn)行表征，通過對比黃芪多糖、黃芪多糖鐵（Ⅲ）復(fù)合物，以及三氯化鐵的紫外光譜，發(fā)現(xiàn)黃芪多糖中羰基可能與鐵發(fā)生反應(yīng)，生成黃芪多糖鐵（Ⅲ）復(fù)合物；而紅外光譜表明黃芪多糖與鐵絡(luò)合，鐵化反應(yīng)可能是發(fā)生在-OH上，這與Q.L［15］文獻(xiàn)報道的一致。

以蘆丁為陽性對照，通過DPPH清除、ABTS清除、羥自由基清除和總還原力測定四種抗氧化試驗，對APS和APS-Fe的抗氧化能力進(jìn)行評價，發(fā)現(xiàn)APS和APS-Fe均具有一定的抗氧化能力，且抗氧化能力呈劑量依賴性。實驗還發(fā)現(xiàn)APS-Fe的抗氧化能力稍低于APS,說明APS生成APS-Fe時，一些羥基、羰基與鐵復(fù)合，使得APS-Fe的抗氧化活性降低，從側(cè)面說明羥基和羰基是APS生成APS-Fe時發(fā)生反應(yīng)的基團(tuán)。

本實驗合成APS-Fe復(fù)合物，具有穩(wěn)定的鐵含量，并具有一定的抗氧化活性，為APS-Fe的后期研發(fā)提供了一定的實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)，同時也為后續(xù)將APS-Fe開發(fā)成一種具有多重保健功能的生物多糖型補(bǔ)鐵劑具有借鑒意義。