申 利 魏軍成

宮頸癌是導(dǎo)致女性相關(guān)死亡的第四大原因，雖然其發(fā)病率和死亡率在過去30年有所下降，但晚期患者的5年生存率仍低于40%[1]。目前，許多宮頸癌患者接受術(shù)前和術(shù)后輔助化療被認(rèn)為是治療多種癌癥最有效的治療方法，但由于對化學(xué)藥物的耐藥性，影響了化療的療效[2]。因此，許多研究人員致力于闡明癌細(xì)胞如何獲得化療耐藥性的機(jī)制，從而為腫瘤的治療提供新策略。miRNA是一種非編碼單鏈RNA，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。miRNA功能障礙涉及許多病理過程，包括癌癥[3]。研究中證實，miRNA的失調(diào)參與了腫瘤細(xì)胞對化療藥物耐藥的調(diào)節(jié)[4]。因此，致癌miRNA的失活和抑癌miRNA的恢復(fù)是癌癥治療有希望的策略。最近的研究表明，miRNA-409-3p被認(rèn)為是一種腫瘤抑制因子miRNA，但miRNA-409-3p抑制宮頸癌的機(jī)制仍不清楚[5]。自噬被認(rèn)為是誘導(dǎo)癌細(xì)胞化學(xué)抗性的因素之一，使用3-甲基腺嘌呤(3-MA)抑制自噬可能降低乳腺癌細(xì)胞的化療耐藥性，抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖[6]。因此，本研究檢測宮頸癌組織中miRNA-409-3p的表達(dá)情況，并分析其對細(xì)胞增殖及順鉑敏感性的影響，為臨床治療順鉑耐藥宮頸癌患者提供新方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

宮頸癌HeLa細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫；順鉑購自齊魯制藥廠；miRNA-409-3p特異性siRNA和陰性對照(NC)購自上海吉瑪生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清購自美國Gibco公司；細(xì)胞計數(shù)試劑盒8(CCK-8)購自美國Amresco公司；Trizol購自美國Invitrogen公司；Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連TaKaRa公司；Ultra SYBR One Step RNA PCR Kit熒光定量PCR試劑盒購自寶生物工程大連有限公司；PCR引物序列由大連TaKaRa公司設(shè)計并合成：miRNA-409-3p上游引物為5′-UAACACUGUCUGGUAACGAUGU-3′，下游引物為：5′-AUC GUUACCAGACAGUGUUAUU-3′；β-actin上游引物為5′-TCCCATCACCATCTTCCAG-3，下游引物為：5-GGTATCCATCGCCATGCTC-3′；細(xì)胞蛋白抽提試劑購自碧云天生物技術(shù)研究所；鼠抗Fip200、LC3和β-actin單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記親和純化山羊抗鼠IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Ther-mo Revco公司；HBS-1096B酶標(biāo)儀購自南京德鐵實驗設(shè)備有限公司；NanoDrop2000c型蛋白核酸檢測儀購自美國Thermo公司；實時熒光定量PCR儀和垂直電泳儀購自美國BIO-RAD公司；凝膠成像儀購自美國UVP公司。

1.2 組織來源

組織樣本來自我院2016年1月—2018年12月原發(fā)性宮頸癌標(biāo)本120例，并選取癌旁組織(距腫瘤邊緣>5 cm)，所有患者術(shù)前均未接受化療或放療。同時選取良性腫瘤(子宮肌瘤、子宮腺肌癥患者行全子宮切除者，術(shù)后病理證實宮頸組織無異常)患者的正常宮頸組織110例，所有研究對象平均年齡(54.43±4.57)歲。各組織樣本均由本院病理學(xué)專家檢查并確認(rèn)。研究同意我院倫理委員會批準(zhǔn)，嚴(yán)格按照《赫爾辛基宣言》執(zhí)行。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

用含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HeLa細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合至70%左右時進(jìn)行實驗。將細(xì)胞隨機(jī)分為3組：正常對照組、NC對照組和miRNA-409-3p mimic組。NC對照組和miRNA-409-3p mimic組HeLa細(xì)胞分別用Lipofectamine法將陰性對照(NC)和miRNA-409-3p mimic轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收獲細(xì)胞，進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.4 RT-PCR檢測miRNA-409-3p mRNA表達(dá)

取標(biāo)本組織和轉(zhuǎn)染后的HeLa細(xì)胞，進(jìn)行總RNA提取，測定mRNA濃度和純度，將提取的總RNA根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，根據(jù)SYBR Premix Ex Taq TM II熒光定量PCR試劑盒說明書，用制備20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。以β-actin作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算miRNA-409-3p mRNA的相對表達(dá)量。

1.5 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖率

三組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后以5×103/孔接種于96孔板中，200 μL/孔，待細(xì)胞貼壁分別不加入順鉑和加入終濃度為10 μg/L的順鉑，繼續(xù)培養(yǎng)0h、6 h、12 h、24 h、36 h和48 h后，向培養(yǎng)板中加入10 μL CCK-8試劑，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀在630 nm處測定吸光度值，計算細(xì)胞增殖率，每組設(shè)3個平行孔。

1.6 Western blot法檢測Fip200和LC3蛋白的表達(dá)水平

三組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，加入含順鉑(14 μg/mL)的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，收獲細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞蛋白質(zhì)的提取，進(jìn)行電泳、切膠；分別孵育Fip200和LC3蛋白一抗，4℃下過夜，孵育相對于二抗，采集圖像進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 正常宮頸組織、宮頸癌旁組織與宮頸癌組織中miRNA-409-3p的表達(dá)

正常宮頸組織中miRNA-409-3p mRNA的相對表達(dá)水平高于宮頸癌組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；宮頸癌旁組織與正常宮頸組織miRNA-409-3p mRNA的相對表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 正常宮頸組織、宮頸癌旁組織與宮頸癌組織中miRNA-409-3p的表達(dá)

Table 1 Expression of miRNA-409-3p in normal cervical tissue，paracancerous tissues and cervical cancer tissues

GroupCasesmiRNA-409-3pNormal cervical tissue1101.00±0.05 Paracancerous tissues1200.94±0.06 Cervical cancer tissues1200.18±0.02#*

Notes：#P<0.05，when compared with normal cervical tissues；*P<0.05，when compared with paracancerous tissues.

2.2 轉(zhuǎn)染miRNA-409-3p mimic后各組細(xì)胞中miRNA-409-3p mRNA的表達(dá)

通過轉(zhuǎn)染miRNA-409-3p mimic后，miRNA-409-3p mimic組miRNA-409-3p mRNA的相對表達(dá)水平較正常對照組顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示miRNA-409-3p被高效轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。NC對照組與正常對照組miRNA-409-3p mRNA的相對表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

表2 轉(zhuǎn)染miRNA-409-3p mimic后各組細(xì)胞中miRNA-409-3p mRNA的表達(dá)

Table 2 Expression of miRNA-409-3p mRNA in Hela cells transferred with miRNA-409-3p mimic and its controls

GroupCasesmiRNA-409-3pNormal control 31.00±0.04 NC control31.03±0.05 miRNA-409-3p mim-ic34.26±0.32#*

Notes：#P<0.05，when compared with the normal control group；*P<0.05，when compared with the RNA control group.

2.3 轉(zhuǎn)染miRNA-409-3p mimic后各組細(xì)胞增殖的影響

正常對照組和NC對照組的細(xì)胞增殖率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；miRNA-409-3p mimic組HeLa細(xì)胞增殖率較正常對照組和NC對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

表3 轉(zhuǎn)染miRNA-409-3p mimic后各組細(xì)胞增殖的影響

Notes：#P<0.05，when compared with the normal control group；*P<0.05，when compared with the RNA control group.

2.4 轉(zhuǎn)染miRNA-409-3p mimic后順鉑對各組細(xì)胞增殖率的影響

給予順鉑干預(yù)后，正常對照組和NC對照組的細(xì)胞增殖率先降低后迅速增長，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；給予順鉑干預(yù)后，與正常對照組和NC對照組相比，miRNA-409-3p mimic組的細(xì)胞增殖率明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表4)。

表4 轉(zhuǎn)染miRNA-409-3p mimic后順鉑對各組細(xì)胞增殖率的影響

Notes：#P<0.05，when compared with the normal control group；*P<0.05，when compared with the RNA control group.

2.5 轉(zhuǎn)染miRNA-409-3p mimic后順鉑對各組細(xì)胞中Fip200和LC3蛋白表達(dá)的影響

給予順鉑干預(yù)后，正常對照組和NC對照組細(xì)胞中Fip200蛋白表達(dá)水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；給予順鉑干預(yù)后，與正常對照組和NC對照組相比，miRNA-409-3p mimic組細(xì)胞中Fip200蛋白表達(dá)水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1，表5)。

表5 轉(zhuǎn)染miRNA-409-3p mimic后順鉑對各組細(xì)胞中Fip200和LC3蛋白表達(dá)的影響

Table 5 Effects of cisplatin on the expression of Fip200 and LC3 proteins in Hela cells after transfected with miRNA-409-3p mimic

GroupCasesFip200 LC3Ⅱ/LC3ⅠNormal control 30.57±0.040.24±0.03NC control30.60±0.070.21±0.04miRNA-409-3p mim-ic30.29±0.03#*0.10±0.02#*

Notes：#P<0.05，when compared with the normal control group；*P<0.05，when compared with the RNA control group.

圖1 轉(zhuǎn)染miRNA-409-3p mimic后順鉑對各組細(xì)胞中Fip200和LC3蛋白表達(dá)的影響Figure 1 Effects of cisplatin on the expression of Fip200 and LC3 proteins in Hela cells after transfected with miRNA-409-3p mimic

3 討論

miRNA的異常表達(dá)參與了宮頸癌的病理生理過程[7]。近期研究表明，miRNA-409-3p在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。例如，miRNA-409-3p通過靶向IRS2抑制直結(jié)腸癌細(xì)胞的生長和侵襲[8]；同時，miRNA-409-3p靶向調(diào)控ZEB1，影響乳腺癌細(xì)胞增殖和代謝[9]。然而，miRNA-409-3p在宮頸癌中的表達(dá)和功能尚不清楚。本研究結(jié)果提示，上調(diào)miRNA-409-3p的表達(dá)可以抑制宮頸癌細(xì)胞增殖。

阿霉素是多種癌癥的一線臨床治療方案，但其耐藥性影響了臨床療效。自噬與多種常見疾病相關(guān)，在許多腫瘤中觀察到失調(diào)的自噬活性[10]。研究發(fā)現(xiàn)，自噬是腫瘤細(xì)胞耐藥性的重要組成部分。γ輻射可以觸發(fā)自噬，由此誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對化療的耐藥性，而且自噬誘導(dǎo)缺氧也加速乳腺癌細(xì)胞對化療治療的耐藥性[11-12]。研究表明惡性腫瘤中的miRNA與自噬的調(diào)控相關(guān)，這可能影響腫瘤細(xì)胞對某些化療藥物的耐藥性[13]。因為越來越多的研究表明，自噬是由miRNA調(diào)控，并在腫瘤細(xì)胞耐藥過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，有研究建議將其作為開發(fā)分子特異性療法的目標(biāo)的潛力。

在對卵巢癌的研究發(fā)現(xiàn)，通過上調(diào)miR-409-3p水平，可以抑制Fip200介導(dǎo)的自噬，從而增加OV-1063細(xì)胞對順鉑的敏感性，證實了自噬是腫瘤細(xì)胞耐藥形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[14]。Fip200是哺乳動物Atg17基因表達(dá)的目標(biāo)蛋白，在自噬起始過程中起關(guān)鍵作用。以多種細(xì)胞系和小鼠模型為研究對象，發(fā)現(xiàn)Fip200在自噬過程中起著不可或缺的作用[15]。同時，將OV-1063細(xì)胞移植到裸鼠的實驗結(jié)果表明，F(xiàn)ip200介導(dǎo)的自噬是被miR-409-3p抑制，從而增強(qiáng)OV-1063細(xì)胞對順鉑的化療敏感性[16]。通過生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，miR-409-3p與Fip200 mRNA的3′-UTR結(jié)合，并在OV-1063細(xì)胞的雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炛械玫津炞C[14]。自噬蛋白標(biāo)記物L(fēng)C3在自噬激活時由LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為酶促LC3-Ⅱ，LC3B-I蛋白向LC3B-II的轉(zhuǎn)化是自噬體形成過程中自噬誘導(dǎo)的一個標(biāo)志[17]。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)miRNA-409-3p的表達(dá)可以降低Fip200蛋白表達(dá)水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，抑制了自噬的發(fā)生，增加HeLa細(xì)胞對順鉑的敏感性，提示miRNA-409-3p通過參與自噬調(diào)控腫瘤細(xì)胞對順鉑的敏感性。

綜上所述，miRNA-409-3p在宮頸癌組織中低表達(dá)，上調(diào)miRNA-409-3p水平可以抑制HeLa細(xì)胞增殖，增加HeLa細(xì)胞對順鉑的敏感性，其機(jī)制可能與抑制Fip200表達(dá)有關(guān)，但其作為臨床治療宮頸癌的方法還需要大量研究加以論證。