張蓓蕾 李 怡 吳 濤 姜 鋒 趙宏喜 李艷紅

卵巢癌是常見的婦科腫瘤之一[1]。傳統(tǒng)的卵巢癌治療方法有手術治療和化療，然而這些治療方法療效有限，且化療藥物的耐藥性極大地降低了治療的敏感性，影響臨床療效[2]。因此，尋找安全有效、耐藥逆轉的天然藥物是目前卵巢癌治療的有效途徑之一。血根堿(Sanguinarine，SANG)是一種來源于罌粟科植物博落回的提取物。SANG已被證明具有抗菌、抗氧化和抗炎特性[3-4]。當以微摩爾濃度使用時，SANG能夠抑制多種腫瘤細胞系的生長，誘導腫瘤細胞與正常細胞的選擇性細胞凋亡反應。到目前為止，已經在多種腫瘤細胞中證實了SANG的抗增殖和促凋亡活性，包括表皮、前列腺、乳腺、結腸和骨肉瘤等腫瘤細胞[5]。然而，SANG對卵巢癌細胞的作用機制少見報道，在小鼠卵巢癌移植腫瘤模型的體內效應研究則更少。因此，本研究以人類卵巢癌細胞SKOV3為研究對象，在細胞水平和動物水平研究SANG對卵巢癌生長、凋亡的影響，并揭示其作用機制，為SANG用于卵巢癌的臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

SANG購自美國Sigma公司；信號通路抑制劑BAY11-7082、LY294002和SB203850購自中國碧云天公司；CCK-8試劑盒、caspase-3活性測定試劑盒、BCA蛋白質測定試劑盒、活性氧(ROS)測定試劑盒購自中國碧云天公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自美國BD Pharmingen公司；一抗和二抗購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；卵巢癌細胞SKOV3購自中國科學院上海細胞庫，并在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中補充10%胎牛血清，1%谷氨酰胺，100 mg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素。

1.2 細胞活力測定

使用CCK-8試劑盒測定SANG對細胞活力的影響。具體步驟為，將細胞接種在96孔板(5×103細胞/孔)中，設立5組不同濃度SANG處理組(0 μM、0.5 μM、1 μM、2 μM、4 μM)，作用24 h后向每個孔中加入10 μL CCK-8，4 h后用酶標儀測量450 nm處的吸光度值。

1.3 免疫蛋白印記

收獲細胞，加入RIPA裂解緩沖液，冰上裂解10 min。收集上清液，使用BCA蛋白質測定試劑盒測定蛋白質濃度。將等量的蛋白質提取物(20 μg)加載到SDS-PAGE凝膠中并轉移到PVDF膜上，在室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h后，將轉移的膜與caspase-3抗體、JNK抗體、p-JNK抗體、IκBα抗體或actin抗體等一抗在室溫下孵育1 h，然后與IgG-HRP二抗孵育另外1 h。使用ECL檢測儀器檢測免疫反應性，使用Image J軟件定量蛋白質條帶。

1.4 流式細胞術分析

使用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測由SANG誘導的細胞凋亡。具體步驟為，收獲細胞并用PBS洗滌兩次，將細胞懸浮于1 mL Annexin-V結合緩沖液中，在室溫下孵育15 min，加入PI(5 μg/mL)并用Accuri C6流式細胞儀分析凋亡細胞，C Flow Plus軟件用于確定相對DNA含量。

1.5 體外caspase-3活性測定

使用caspase-3活性測定試劑盒測量caspase-3活性。具體步驟為，收集用不同濃度的SANG(0 μM、0.5 μM、1 μM、2 μM、4 μM)或對照DMSO處理的細胞，洗滌并加入裂解緩沖液，冰上裂解30 min，然后12 000 rpm離心10 min，收集上清液。隨后向每個樣品中加入Ac-DEVD pNA(2 mM)并在37℃下孵育1 h，最后使用分光光度計在405 nm波長下定量每個樣品的光密度。p-NA標準用于校準每個樣品的caspase-3活性。

1.6 ROS含量的檢測

使用ROS檢測試劑盒檢測細胞內ROS的含量。具體步驟為，將細胞接種在24孔板上，并用不同濃度(0 μM、0.5 μM、1 μM、2 μM、4 μM)的SANG或NAC抑制劑處理不同的時間，向細胞中加入10 mM DCFH-DA并在37℃下孵育30 min，最后通過熒光分光光度計測量激發(fā)/發(fā)射波長為488/525 nm的OD值確定細胞中的ROS含量。

1.7 體內動物實驗

所有實驗動物操作嚴格依照空軍軍醫(yī)大學頒發(fā)的《實驗動物管理條例》，實驗裸鼠(約4周)購自空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心。收集懸浮在PBS中的1×107個卵巢癌細胞SKOV3注射到裸鼠(n=5)中來制備異種移植腫瘤模型。在腫瘤達到約100 mm3的體積后，小鼠尾靜脈注射SANG或DMSO對照。在整個實驗期間，一組荷瘤小鼠(n=5)每隔一天靜脈注射10 mg/kgSANG，而對照組小鼠(n=5)僅注射DMSO。腫瘤生長測量計算為LW2/2，其中L表示腫瘤長直徑，W表示短直徑。

1.8 TUNEL染色

處死小鼠并收集腫瘤樣品并切片，使用TUNEL凋亡檢測試劑盒，通過末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL)測定來確定DNA片段，以判定組織凋亡情況。

1.9 統(tǒng)計分析

2 結果

2.1 SANG對細胞生長和凋亡的影響

CCK-8結果顯示與對照組(0 μM)相比，不同濃度SANG處理組有效抑制了SKOV3細胞的增殖，且呈劑量依賴性(圖1A)。Western blot結果顯示，與對照組相比，SANG處理后顯著激活了caspase-3的表達(圖1B)。其次，流式細胞術分析表明，與對照組相比，不同濃度的SANG處理后，凋亡細胞的百分比隨著細胞中SANG濃度的增加而增加(圖1C)。這些結果表明SANG顯著誘導SKOV3細胞凋亡，并抑制其細胞生長。

圖1 SANG對細胞活力和細胞凋亡的影響Figure 1 Effects of SANG on viability and apoptosis of SKOV3 cellsNote：A.CCK-8 assay for cell viability；B.Western blot assay to detect the expression of caspase-3；C.Apoptosis analysis by flow cytometry.*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，when compared with the with the negative control group.

2.2 ROS的產生參與SANG誘導的細胞凋亡

caspase-3活性結果顯示，與對照組相比，不同劑量的SANG顯著刺激了caspase-3活性的增加，并呈劑量依賴性(圖2A)。ROS檢測結果顯示，與對照組相比，隨著SKOV3細胞中使用SANG濃度的增加，ROS的產生逐漸增加(圖2B)。然而，用ROS抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)預處理細胞不同時間后，與SANG處理組相比，SANG+NAC聯(lián)合處理組極大地抑制了SKOV3細胞中ROS的產生，并且抑制是呈時間依賴性的(圖2C)。我們進一步發(fā)現(xiàn)，與SANG單獨處理組相比，不同濃度的SANG+NAC聯(lián)合處理組或NAC單獨處理組顯著抑制了細胞中caspase-3的活性，并且呈現(xiàn)濃度梯度依賴性(圖2D)。這些結果表明活性氧ROS的產生參與了SANG誘導的細胞凋亡。

2.3 SANG誘導的細胞凋亡與JNK和NF-κB信號通路的激活有關

細胞信號通路的激活，如核因子-κB(NF-κB)、c-JunN-末端激酶(JNK)或P38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)，參與調節(jié)細胞生長和細胞死亡。因此，我們進一步采用信號通路抑制劑探究這些信號通路是否參與SANG誘導的細胞凋亡。結果顯示，與SANG處理組相比，SANG+BAY11-7082或SANG+SP600125處理組顯著減弱了caspase-3活性。相反，與SANG處理組相比，SANG+SB203850處理組對caspase-3活性的變化幾乎沒有影響(圖3A)。Western blot結果進一步顯示，與對照組相比，SANG處理后明顯導致了SKOV3細胞中p-JNK和IκBα蛋白的升高，從而證明了SANG誘導的細胞凋亡過程中NF-κB和JNK信號通路被激活(圖3B)。

圖2 ROS產生參與SANG誘導的細胞凋Figure 2 ROS was involved in SANG-induced apoptosis of SKOV3 cellsNote：A.Caspase-3 activity assay；B.ROS release in cells treated with different concentrations of SANG；C.ROS release in cells treated with SANG and different concentrations of NAC；D.Caspase-3 activity in cells treated with SANG and different concentrations of NAC.*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，when compared with the ctrl or SANG group.

圖3 JNK和NF-κB信號通路的激活介導SANG誘導的細胞凋亡Figure 3 SANG-induced apoptosis was associated with activation of JNK and NF-κB signal pathwaysNote：A.Caspase-3 activity in cells treated with SANG and different inhibitors；B.Western blot assay to detect P-JNK，JNK and IκBα expression.***P<0.01，when compared with the SANG group.

2.4 SANG抑制小鼠移植瘤模型腫瘤生長

小鼠腫瘤生長曲線顯示，與對照組小鼠相比，SANG處理組的小鼠表現(xiàn)出顯著的腫瘤生長遲緩。治療三周后，與對照組相比，SANG處理組的小鼠腫瘤負荷減少了60%左右，表明SANG具有很強的抑制腫瘤功效(圖4A)。此外，在實驗結束時沒有觀察到兩組間小鼠體重的變化，說明SANG對動物的毒性很小(圖4B)。腫瘤TUNEL染色結果顯示，與對照組相比，SANG處理組表現(xiàn)為來自凋亡細胞的綠色信號增加，表明SANG導致了更多的細胞凋亡(圖4C)。這些結果證實SANG可以在體內有效誘導細胞凋亡和抑制腫瘤生長。

圖4 SANG體內抑制腫瘤療效評價Figure 4 The therapeutic efficient evaluation of SANG in a mouse model of ovarian cancer xenograftsNote：A.Tumor growth curve；B.Mice body weight；C.TUNEL staining.*P<0.05，**P<0.01，when compared with the vehicle group.

3 討論

大多數(shù)化療藥物主要通過誘導細胞凋亡的途徑來抑制腫瘤進展，并且普遍認為腫瘤化療抵抗與細胞凋亡調控失調相關[6-8]。一些化學治療藥物，包括多柔比星和紫杉醇，通常被認為是廣泛的人類腫瘤治療中的有效藥物。然而，由于耐藥性和難以忍受的毒性，治療通常是暫時的[9]。因此，一直需要探索用于克服這些限制的新型抗腫瘤藥物。天然產物是腫瘤治療的豐富來源，大量植物衍生的藥物具有顯著的抗腫瘤活性，并且越來越多地用于腫瘤化療[10]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)天然產物SANG以劑量和時間依賴性方式誘導卵巢癌細胞凋亡，并且凋亡的誘導介導活性氧ROS的產生以及JNK和NF-κB信號途徑的激活。

越來越多的證據(jù)表明受損的線粒體會刺激活性氧ROS的產生，并且ROS的不成比例的產生會通過激活半胱氨酸蛋白酶導致線粒體受損，并通過內在途徑誘導細胞凋亡[11]。我們的數(shù)據(jù)顯示，SANG在促進細胞凋亡過程中導致ROS的產生顯著增加。與NAC(一種常用的ROS抗氧化劑)共培養(yǎng)，可以有效地阻斷ROS的產生。此外，阻斷ROS的產生完全阻止了細胞凋亡并抑制了SANG誘導的caspase-3的激活。這些結果表明ROS的產生是SANG誘導卵巢癌細胞凋亡所必需的。

通常認為細胞凋亡是動態(tài)且復雜的過程，并且相同藥物在不同腫瘤類型中造成的凋亡可能介導不同的信號通路途徑。Han等[12]報道SANG在治療人膀胱癌細胞的半小時內，JNK信號通路以ROS依賴性方式被激活。然而，特異性JNK抑制劑SP600125預處理并未減弱SANG誘導的細胞凋亡，提示ROS依賴性JNK激活不能介導SANG誘導的膀胱癌細胞凋亡。在另一項研究中[13]，研究人員證實，SANG處理人結直腸癌HCT-116細胞導致p38MAPK和JNK信號通路活化，但特異性抑制劑對這兩種通路的破壞并未顯著阻止SANG誘導的細胞凋亡。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在SKOV3卵巢癌細胞中SANG處理后可導致JNK的磷酸化和IκBα蛋白表達的增加。此外，SANG誘導的促細胞凋亡作用被BAY11-7082或SP610025特異性抑制劑而非SB203850抑制劑阻斷，表明NF-κB和JNK信號通路的激活參與SANG誘導的卵巢癌細胞凋亡。我們推測這些結果之間的不一致是由于使用的不同腫瘤細胞類型所致。

綜上所述，SANG可以抑制卵巢癌細胞的生長，并誘發(fā)卵巢癌細胞的凋亡，其凋亡過程介導ROS的產生以及JNK和NF-κB信號途徑的激活。這些發(fā)現(xiàn)可以更深入地了解SANG的抗腫瘤分子機制，為卵巢癌的治療提供了新的思路和方法。