王進(jìn)有 何 可 謝棟棟 畢良寬 徐德祥 于德新

腎癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)腫瘤之一，絕大多數(shù)細(xì)胞類(lèi)型為透明細(xì)胞癌，腎癌發(fā)病的確切機(jī)制仍未完全闡明，相關(guān)癌基因的表達(dá)和抑癌基因失活在腎癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中扮演重要角色[1-2]。F框/WD-40域蛋白家族(F-box and WD repeat domain-containing，F(xiàn)BXW)可通過(guò)泛素連接酶E3一系列作用將其靶蛋白泛素化降解。在這個(gè)家族蛋白中研究較多的是FBXW7，其處于蛋白網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的中心位置，在細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化、細(xì)胞侵襲、細(xì)胞凋亡、腫瘤轉(zhuǎn)移及腫瘤耐藥等多個(gè)方面發(fā)揮重要功能[3]。

目前關(guān)于F框/WD-40域蛋白10(FBXW10)功能的研究較少，僅知道它是FBXW蛋白家族中的一個(gè)蛋白[4]。課題組前期研究表明FBXW10為抑癌基因，在泛素化降解中的功能可能與FBXW7相似[5]。細(xì)胞周期蛋白E(Cyclin E)是調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程的細(xì)胞周期蛋白家族中的一員，Cyclin E異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，從而引發(fā)腫瘤[6]。本研究擬通過(guò)免疫組化SP法檢測(cè)60例腎透明細(xì)胞癌患者癌組織及其中行根治術(shù)的20例患者癌旁正常腎組織中FBXW10和Cyclin E蛋白的表達(dá)，探討FBXW10和Cyclin E蛋白的臨床意義以及兩者與腎癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院2016年1月—2017年12月手術(shù)切除后病理為腎透明細(xì)胞癌的組織標(biāo)本60例，其中20例取距腫瘤邊緣2 cm以上的癌旁腎組織(病理證實(shí)無(wú)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)明顯炎等病變)作為癌旁正常對(duì)照，男性37人，女性23人。平均年齡58.4(30～82)歲。組織學(xué)分級(jí)Ⅰ～Ⅳ級(jí)分別為11、36、9、4例，分別占總?cè)藬?shù)的比例為18.3%、60.0%、15.0%、6.7%。診斷時(shí)即有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的12例。所有患者經(jīng)我院病理科切片檢查確診為腎透明細(xì)胞癌，術(shù)前均未接受化療或放療治療，患者資料完整。由同一位醫(yī)師查閱病歷資料，收集資料包括性別、年齡、腫瘤分期、是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及腎癌細(xì)胞組織學(xué)分級(jí)等。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批，所有資料獲取及發(fā)表均經(jīng)患者本人或家屬同意，并簽署知情同意書(shū)。

1.2 試劑、染色方法

FBXW10鼠抗單克隆抗體及Cyclin E兔抗單克隆抗體為美國(guó)Santa Cruz公司生產(chǎn)，通用型DAB顯色試劑盒S以及P試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。所有組織標(biāo)本于術(shù)中離體30 min內(nèi)取材，經(jīng)4%甲醛溶液固定，常規(guī)制作石蠟包埋，切片厚度4 μm，均采用免疫組化SP法染色，F(xiàn)BXW10和Cyclin E一抗均稀釋80倍后使用。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，具體步驟嚴(yán)格按操作說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.3 免疫組化結(jié)果判定

所有免疫組化結(jié)果均由兩位未參與研究的病理科醫(yī)生分別獨(dú)立觀察，當(dāng)結(jié)果不一致時(shí)，則由兩人商議做出決定。FBXW10與Cyclin E蛋白的陽(yáng)性表達(dá)可定位于細(xì)胞漿或細(xì)胞核，若細(xì)胞核或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒染色則判定為表達(dá)陽(yáng)性。每例標(biāo)本在400倍光鏡下選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，該標(biāo)本的陽(yáng)性細(xì)胞比率為每個(gè)視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均數(shù)。FBXW10陰性定義為陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)<20%，≥20%定義為陽(yáng)性；Cyclin E陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)<5%為陰性，≥5%為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)，率的比較采用卡方檢驗(yàn)，腎癌組織中FBXW10、Cyclin E表達(dá)的關(guān)聯(lián)性采用卡方檢驗(yàn)計(jì)算列聯(lián)系數(shù)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FBXW10蛋白與Cyclin E蛋白表達(dá)

FBXW10蛋白在腎透明細(xì)胞癌及其癌旁正常組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別是40.0%和70.0%，Cyclin E蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別是55.0%和25.0%，兩種蛋白在腎癌及其癌旁正常組織中的陽(yáng)性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。FBXW10蛋白與Cyclin E蛋白的細(xì)胞漿和細(xì)胞核棕黃色顆粒染色為陽(yáng)性(圖1-2)。

圖1 腎透明細(xì)胞癌組織及癌旁正常組織中FBXW10蛋白的表達(dá)(400×)Figure 1 Expression of FBXW10 in the renal cancer and adjacent normal tissues(400×)Note：A.Expression of FBXW10 in renal clear cell carcinoma tissues；B.Expression of FBXW10 in adjacent normal tissues.

圖2 腎透明細(xì)胞癌組織及癌旁正常組織中Cyclin E蛋白的表達(dá)(400×)Figure 2 Expression of cyclin E in renal clear cell carcinoma and adjacent normal tissues(400×)Note：A.Expression of cyclin E in renal clear cell carcinoma tissue；B.Expression of cyclin E in adjacent normal tissues.

表1 腎透明細(xì)胞癌組織及癌旁正常組織中FBXW10 和Cyclin E 蛋白的表達(dá)陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)

2.2 腎透明細(xì)胞癌中FBXW10和Cyclin E蛋白的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

腎透明細(xì)胞癌組織中FBXW10蛋白的表達(dá)率與腎癌組織學(xué)分級(jí)(P=0.041)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.030)相關(guān)，而與性別、年齡、腫瘤分期無(wú)關(guān)(P>0.05)。Cyclin E表達(dá)與腫瘤分期(P=0.005)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.011)、腎癌組織學(xué)分級(jí)(P=0.035)相關(guān)，而與性別、年齡無(wú)關(guān)(P>0.05)(表2)。

表2 腎透明細(xì)胞癌組織及癌旁正常組織中FBXW10和Cyclin E蛋白的表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系

2.3 腎透明細(xì)胞癌組織中FBXW10和Cyclin E蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)性

腎透明細(xì)胞癌組織中FBXW10蛋白呈低表達(dá)、Cyclin E蛋白高表達(dá)，兩者存在相關(guān)性(r=0.533，P<0.001)(表3)。

表3 腎透明細(xì)胞癌組織中FBXW10和Cyclin E蛋白的表達(dá)的關(guān)聯(lián)性

Table 3 Correlation between the expression of fbxw10 and cyclin E proteins in renal clear cell carcinoma tissues

FBXW10Cyclin EPositiveNegativeTotalPositive42024Negative29736Total332760

3 討論

腎細(xì)胞癌是泌尿生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)其發(fā)病率逐漸升高，且發(fā)病年齡逐漸年輕化，已成為影響國(guó)民健康的主要威脅之一。腎細(xì)胞癌中最常見(jiàn)的類(lèi)型為透明細(xì)胞癌，約占全部病理類(lèi)型的85%。腎癌惡性度較高，25%的腎癌病例就診時(shí)已為晚期病變，我國(guó)每年因腎癌死亡的人數(shù)高達(dá)到2萬(wàn)[1-2]。晚期腎癌對(duì)常規(guī)放、化療不敏感，即使靶向治療也療效有限，且價(jià)格極為昂貴，給家庭、社會(huì)帶來(lái)沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[7]。腎癌治療的一大瓶頸是其發(fā)生、發(fā)展機(jī)制尚不清楚，缺乏明確的治療靶點(diǎn)。探明腎癌的發(fā)生、發(fā)展的其他機(jī)制是目前臨床上迫切需要解決的醫(yī)學(xué)熱點(diǎn)之一，這也是早期診斷并尋找新的、有效的腎癌靶向治療的主要切入點(diǎn)。

泛素是一類(lèi)分子量為9 KD的蛋白質(zhì)，泛素化是指泛素分子在一系列特殊酶的作用下，將細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)行分類(lèi)，從中選出靶蛋白分子，并對(duì)靶蛋白特異性修飾或降解的過(guò)程。泛素化修飾涉及泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2和泛素連接酶E3催化的一系列連續(xù)反應(yīng)。SCF類(lèi)E3復(fù)合體是泛素連接酶E3中的一種，由支架蛋白(Cul1)、環(huán)指蛋白(Rbx1)、銜接蛋白(Skp1)和一個(gè)F-box蛋白組成，其中F-box蛋白類(lèi)決定底物特異性[8-9]。

最近鑒定出了一種新穎的WD-40重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白家族，即F-box蛋白家族，其靶蛋白通過(guò)泛素連接酶E3的一系列作用被泛素化而降解。在這個(gè)家族中研究較多的是FBXW7，其含有7個(gè)WD-40重復(fù)結(jié)構(gòu)域，具有抑癌基因的潛能。FBXW7處于蛋白網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的中心位置，在細(xì)胞分裂、分化、凋亡、侵襲以及腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤耐藥等多個(gè)方面發(fā)揮重要功能。在細(xì)胞生物學(xué)中具有重要作用的cyclin E、c-myc、c-jun和Notch等蛋白都是通過(guò)FBXW7介導(dǎo)的蛋白酶體途徑進(jìn)行降解[3，10]。FBXW7可通過(guò)促進(jìn)體內(nèi)KLF5泛素化降解從而抑制脂類(lèi)代謝和細(xì)胞增殖，進(jìn)而影響腫瘤發(fā)展；FBXW7可以通過(guò)促進(jìn)Mcl-1降解，加快細(xì)胞凋亡；FBXW7可以通過(guò)泛素化蛋白酶作用促使DAB2IP降解；在腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)及癌癥發(fā)生中，Usp28通過(guò)去泛素化作用，抑制FBXW7對(duì)c-Myc、Jun等蛋白的泛素化降解進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生。Iwatuki等發(fā)現(xiàn)FBXW7在惡性腫瘤組織中的表達(dá)較癌旁組織明顯降低[11]。Du等研究發(fā)現(xiàn)惡性程度高的食道癌組織中FBXW7低表達(dá)或表達(dá)缺失，F(xiàn)BXW7表達(dá)水平與腫瘤組織的惡性程度及患者的生存率具有相關(guān)性[12]。FBXW7靶向降解cyclin E與淋巴腫瘤和胰腺癌的發(fā)生密切相關(guān)[13]。

FBXW10基因位于人染色體17p11.2，其表達(dá)產(chǎn)物FBXW10結(jié)構(gòu)中包含三個(gè)保守的蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)域：F-box、WD重復(fù)序列和D結(jié)構(gòu)域。F-box基序由N端的40個(gè)氨基酸組成，該基序和SKPl直接結(jié)合，發(fā)揮泛素連接酶活性，10個(gè)WD40重復(fù)序列，介導(dǎo)FBXW10與靶底物的結(jié)合；D結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)FBXW10的二聚化。FBXW10與FBXW7雖為同一家族蛋白，具有相似的結(jié)構(gòu)域，但兩個(gè)基因在染色體的定位是完全不同的，兩個(gè)蛋白的功能可能不全相同?；仡櫸墨I(xiàn)，目前關(guān)于FBXW10的研究較少，僅知道它是FBXW蛋白家族中的另一個(gè)蛋白，是一種泛素-蛋白酶連接蛋白，參與核纖層蛋白誘導(dǎo)的某些HP1亞型的蛋白酶體降解，其在泛素化降解中其功能可能與FBXW7相似，F(xiàn)BXW10的功能有待深入研究[14-15]。課題組前期研究顯示腎癌組織和腎癌細(xì)胞株中FBXW10基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島高度甲基化。FBXW10在腫瘤組織啟動(dòng)子平均甲基化率與Fuhrman分級(jí)呈正相關(guān)，初步說(shuō)明FBXW10為抑癌基因，其啟動(dòng)子高甲基化是其表達(dá)下調(diào)的可能機(jī)制[5]。本研究顯示FBXW10在腎透明細(xì)胞癌組織中低表達(dá)，腎透明細(xì)胞癌及其癌旁正常組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別是40.0%和70.0%，陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腎癌細(xì)胞組織學(xué)分級(jí)越差，或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，其癌組織中FBXW10表達(dá)越低。進(jìn)一步驗(yàn)證了FBXW10為抑癌基因，其表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移。通過(guò)檢測(cè)FBXW10基因甲基化水平或檢測(cè)血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞、血清中FBXW10表達(dá)產(chǎn)物等方法，F(xiàn)BXW10今后可能成為早期診斷腎癌的一種生物標(biāo)志物，并可輔助判斷腫瘤的惡性程度及預(yù)后，為腎癌診斷與治療帶來(lái)幫助。

細(xì)胞周期蛋白E是調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程的細(xì)胞周期蛋白家族中的一員。人類(lèi)Cyclin E基因定位于染色體19q12-q13，編碼由395個(gè)氨基酸組成的分子量為45 KD的蛋白，通常稱為周期蛋白盒。Cyclin E在細(xì)胞周期中G1/S、G2/M和有絲分裂中后期交界點(diǎn)這三個(gè)關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)起著對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行精密調(diào)節(jié)的重要作用。腫瘤的發(fā)生常與這些調(diào)控點(diǎn)的異常調(diào)節(jié)密切相關(guān)。Cyclin E被認(rèn)定為原癌基因，Cyclin E的增高將促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，與腫瘤的侵襲性存在密切關(guān)系。Cyclin E在卵巢癌、宮頸癌、乳癌、肺癌、肝細(xì)胞癌、胃癌、大腸癌等多種惡性腫瘤中均呈過(guò)度表達(dá)，且與腫瘤的惡性程度及預(yù)后相關(guān)[6，16]。Cyclin E在腎癌中的研究不多，有學(xué)者采用免疫印跡法發(fā)現(xiàn)其在腎癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率為65%，Cyclin E的表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于癌周正常腎組織，并有部分病例出現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性，Cyclin E的高表達(dá)同腎癌分級(jí)、分期緊密相關(guān)[17-18]。本研究顯示Cyclin E在腎透明細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，癌旁正常腎組織中低表達(dá)，腎腫瘤病理分期越差、細(xì)胞學(xué)分級(jí)越高或伴有轉(zhuǎn)移患者，其癌組織中Cyclin E表達(dá)越高，這與既往研究結(jié)果一致，進(jìn)一步表明Cyclin E為癌基因，Cyclin E可能影響腎癌的生物學(xué)行為，其高表達(dá)可引起腫瘤細(xì)胞的增殖，與腎癌的發(fā)生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)。

本文分析顯示FBXW10與Cyclin E蛋白在腎透明細(xì)胞癌組織中表達(dá)存在相關(guān)性。我們推測(cè)FBXW10可能通過(guò)泛素化降解Cyclin E誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)阻滯。腎癌中FBXW10低表達(dá)可能導(dǎo)致Cyclin E蛋白的高表達(dá)或蓄積，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的異常增殖，進(jìn)而導(dǎo)致腎癌的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移。

綜上所述，F(xiàn)BXW10與Cyclin E的表達(dá)與腎癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，檢測(cè)結(jié)腎癌中FBXW10與Cyclin E的表達(dá)可以預(yù)測(cè)腫瘤惡性程度。研究FBXW10與腎癌細(xì)胞之間的聯(lián)系和分子機(jī)制很可能揭示一種腎癌發(fā)生發(fā)展的新途徑，為腎癌的診斷和分子靶向治療提供新的方向。