曲雁飛 劉 超 王勃軍 方 琳 張艷橋，2

肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)在世界范圍內(nèi)是發(fā)病率第六高的癌癥，也是癌癥導(dǎo)致的死亡率第三高的惡性腫瘤[1-2]。對(duì)于肝細(xì)胞癌患者，手術(shù)切除是根治肝細(xì)胞癌的最有效的方式[3]，但是大部分的肝細(xì)胞癌患者在疾病診斷時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，失去手術(shù)機(jī)會(huì)。目前對(duì)于肝細(xì)胞癌缺少準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)預(yù)后的分子標(biāo)志物和有效的治療靶點(diǎn)。所以，尋找肝細(xì)胞癌早診和預(yù)后標(biāo)志物，對(duì)于提高肝細(xì)胞癌的早期診斷率，提高患者的5年生存率具有重要意義[4]。

COP9信號(hào)復(fù)合體(Constitutive photomorphogenesis 9 signalosome，COPS，CSN)最早是在植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)的一種高度保守的蛋白質(zhì)復(fù)合物，廣泛存在于真核生物中[5]，參與多種蛋白的泛素化降解過(guò)程[6]。組成型光形態(tài)發(fā)生因子9信號(hào)復(fù)合體亞基6(CSN6，COPS6)是COP9信號(hào)復(fù)合體的八個(gè)亞基之一，是組成該復(fù)合體的核心之一[7]。目前多項(xiàng)研究證實(shí)，CSN6在多種腫瘤中，包括乳腺癌[8]、結(jié)直腸癌[9]、膽管癌[10]和卵巢癌[11]等表達(dá)升高，提示該蛋白可能參與腫瘤的進(jìn)展。但是CSN6在肝細(xì)胞癌中的研究未見(jiàn)報(bào)道，本研究旨在探索CSN6在肝細(xì)胞癌患者中的表達(dá)和臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集

本研究中應(yīng)用的病理組織標(biāo)本來(lái)源于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，于2013年1月—2015年12月期間進(jìn)行肝細(xì)胞癌手術(shù)的患者，共106例。所有的腫瘤組織均由我院病理科進(jìn)行石蠟包埋處理，蠟塊置于-20℃凍存。研究的入排標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有病例術(shù)前未進(jìn)行放化療和介入治療；(2)臨床病理信息完整；(3)術(shù)后病理學(xué)明確診斷為肝細(xì)胞癌；(4)排除合并膽管細(xì)胞癌及其他第二腫瘤；(5)排除拒絕提供預(yù)后信息的患者。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理規(guī)定，并得到哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有患者均簽署了相關(guān)知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 腫瘤基因相關(guān)公共數(shù)據(jù)庫(kù) 人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)(The Human Protein Atlas)中調(diào)取肝癌[12]和肝臟組織[13]中CSN6蛋白的免疫組化結(jié)果，明確其在肝細(xì)胞癌和正常肝臟組織中的蛋白表達(dá)。StarBase數(shù)據(jù)庫(kù)分析肝細(xì)胞癌和正常肝臟組織中CSN6的mRNA表達(dá)情況[14]。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)提取肝細(xì)胞癌CSN6表達(dá)數(shù)據(jù)和肝細(xì)胞癌患者的臨床病理信息，分析CSN6表達(dá)與預(yù)后和臨床病理因素的相關(guān)性[15]。

1.2.2 公共數(shù)據(jù)庫(kù)與本研究中心病例隨訪信息的收集 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的隨訪信息由TCGA官方網(wǎng)站定期更新和維護(hù)，本研究中涉及到的肝細(xì)胞癌的隨訪信息更新時(shí)間為2018年11月。本研究中心的患者隨訪起始時(shí)間為病人出院開(kāi)始，終止時(shí)間為2019年4月或者病人死亡，中位隨訪時(shí)間為28個(gè)月?？偵嫫?OS)定義為患者疾病確診直至患者死亡或隨訪終止的時(shí)間。

1.2.3 免疫組化 免疫組化分析106例肝細(xì)胞癌病理組織中的CSN6的表達(dá)。石蠟組織切片在70℃烤箱中烘烤過(guò)夜，第二天分別經(jīng)過(guò)二甲苯、100%、95%、85%和75%的酒精脫蠟以及水化，檸檬酸修復(fù)液煮沸修復(fù)，過(guò)氧化氫和3%BSA封閉，CSN6抗體(1∶50，sc393023)孵育過(guò)夜，第三天用鼠源二抗孵育，DAB顯色，蘇木素染核，脫水封片等處理。免疫組化評(píng)分參考IRS評(píng)分方法[16]，即染色強(qiáng)度分為陰性(0)，弱陽(yáng)性(1)，中度陽(yáng)性(2)，強(qiáng)陽(yáng)性(3)；染色范圍分為0～25%(1)，26%～50%(2)，51%～75%(3)和76%～100%(4)，每張組織的CSN6評(píng)分為兩者得分的乘積。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理利用SPSS 18.0軟件完成，計(jì)量資料采用方差分析和t檢驗(yàn)。χ2檢驗(yàn)分析用來(lái)分析CSN6表達(dá)與各臨床病理因素間的關(guān)系。Kaplan-Meier生存曲線和Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析，單因素和多因素COX回歸分析肝細(xì)胞癌患者預(yù)后影響因素，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CSN6在肝細(xì)胞癌組織中的蛋白表達(dá)和RNA表達(dá)情況

調(diào)取人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)(The Human Protein Altas)中的正常肝臟組織(n=3)和肝細(xì)胞癌組織(n=13)組織芯片中的CSN6的表達(dá)情況，分析發(fā)現(xiàn)CSN6在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)明顯高于正常肝臟組織(P<0.05)(圖1A)。進(jìn)一步調(diào)取StarBase數(shù)據(jù)庫(kù)的CSN6基因在肝細(xì)胞癌(n=374)和正常肝臟組織(n=50)中的mRNA數(shù)據(jù)，對(duì)比顯示CSN6的mRNA表達(dá)水平在肝細(xì)胞癌組織中明顯升高(P<0.001)(圖1B)。結(jié)果說(shuō)明CSN6的蛋白和RNA水平在肝細(xì)胞癌組織中明顯升高。

2.2 CSN6在肝細(xì)胞癌TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)和臨床意義

為了進(jìn)一步分析CSN6在肝細(xì)胞癌中表達(dá)的臨床意義和對(duì)預(yù)后的提示作用，本研究下載了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的CSN6的表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。對(duì)TCGA臨床數(shù)據(jù)中包含的TNM分期數(shù)據(jù)和腫瘤的病理分級(jí)情況加以分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CSN6在T2、T3分期的患者中的表達(dá)情況均高于T1期患者(圖2A)；CSN6在TNM分期的Ⅱ、Ⅲ期患者中的表達(dá)均高于Ⅰ期患者(圖2B)；CSN6在病理分級(jí)高的腫瘤組織中的表達(dá)高于G1和G2分級(jí)的患者(圖2C)。雖然在T4期和Ⅳ期的患者中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與低分期患者間在表達(dá)上的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是我們考慮可能和這兩組患者的數(shù)量較少有關(guān)。

圖1 公共數(shù)據(jù)庫(kù)中CSN6在肝臟組織和肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)Figure 1 Expression of CSN6 in normal hepatic tissues and hepatocellular carcinoma tissues in public databasesNote：A The expression of CSN6 protein in normal hepatic tissues and hepatocellular carcinoma tissues in the Human Protein Atlas database，scale bar =200 μm；B The expression of CSN6 mRNA in normal hepatic tissues(n=50)and hepatocellular carcinoma tissues(n=374)in the StarBase database.* P<0.05，when compared to the corresponding group.

圖2 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的肝細(xì)胞癌中CSN6的表達(dá)和臨床意義Figure 2 Expression and clinical significance of CSN6 in hepatocellular carcinoma of the TCGA databaseNote：A.Expression of CSN6 in different T stages；B.Expression of CSN6 in different TNM stages；C.Expression of CSN6 in different tumor pathological grades.The expression of CSN6 and prognosis were analyzed in hepatocellular carcinoma from TCGA database；D.All stages；E.Early stage；F.Middle and late stages.ns P>0.05，* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001，when compared to the corresponding group.

CSN6在肝細(xì)胞癌預(yù)后指導(dǎo)上的意義，也通過(guò)對(duì)該數(shù)據(jù)進(jìn)行生存曲線的分析得以評(píng)價(jià)。在所有TNM分期的患者中發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)CSN6組(n=82)的預(yù)后明顯低于低表達(dá)CSN6組(n=282)，中位總生存期為837天vs. 1 852天(圖2D)。在早期的患者(TNM分期Ⅰ期和Ⅱ期)中，高表達(dá)CSN6組(n=56)的預(yù)后明顯低于低表達(dá)CSN6組(n=198)，中位總生存期為2 532天vs. 3 258天(圖2E)。在晚期的患者(TNM分期Ⅲ期和Ⅳ期)中，高表達(dá)CSN6組(n=12)的預(yù)后明顯低于低表達(dá)CSN6組(n=74)，中位總生存期為344天vs. 802天(圖2F)。這一結(jié)果提示，CSN6對(duì)于所有分期的肝細(xì)胞癌患者的總生存期具有一定的指導(dǎo)意義。

2.3 CSN6表達(dá)水平與臨床病理因素的關(guān)系

TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中包含的臨床病理因素相對(duì)局限。為了更加廣泛地分析CSN6與肝細(xì)胞癌患者其它臨床病理因素的相關(guān)性，我們收集了106例肝細(xì)胞癌患者術(shù)后的組織標(biāo)本，進(jìn)行免疫組化和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。免疫組化檢測(cè)了106例肝細(xì)胞癌患者的病理組織，并利用IRS評(píng)分方法進(jìn)行評(píng)分，結(jié)果顯示CSN6在大多數(shù)的肝細(xì)胞癌組織中存在表達(dá)，將評(píng)分大于或者等于6分的分為高表達(dá)組(n=37)，評(píng)分低于6分的分為低表達(dá)組(n=69)(圖3A)。CSN6表達(dá)與各個(gè)臨床病理因素的關(guān)系分析顯示，CSN6高表達(dá)與腫瘤分化程度和乙肝病毒感染有關(guān)(表1)。進(jìn)一步的單因素和多因素回歸分析顯示，腫瘤分化程度低、TNM分期晚和CSN6高表達(dá)是肝細(xì)胞癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素(表2)。

2.4 CSN6表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系

我們結(jié)合本中心組織標(biāo)本信息和患者的總生存時(shí)間，分析CSN6在肝細(xì)胞癌患者腫瘤組織中的表達(dá)對(duì)總生存期的潛在指導(dǎo)價(jià)值。Kaplan-Meier生存曲線和Log-rank檢驗(yàn)分析顯示，CSN6低表達(dá)組患者的總生存期明顯優(yōu)于CSN6高表達(dá)組(中位總生存期：1 463天vs.858天)(圖3B)。這一結(jié)果提示，CSN6表達(dá)情況可能成為預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的潛在標(biāo)志物，可以為肝細(xì)胞癌患者疾病發(fā)展的判斷提供了一定指導(dǎo)。

表1 CSN6基因表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者各臨床病理因素的關(guān)系

表2 各臨床病理因素與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后關(guān)系的單因素和多因素分析

圖3 CSN6在肝細(xì)胞癌病理組織中的表達(dá)和對(duì)患者預(yù)后的指導(dǎo)Figure 3 Expression of CSN6 in the pathology of hepatocellular carcinoma and guidance for patient prognosisNote：A.High expression and low expression of CSN6 in the pathology of hepatocellular carcinoma, scale bar =200 μm；B.Overall survival analysis of hepatocellular carcinoma patients with high expression of CSN6 and patients with low expression of CSN6.

3 討論

HCC在男性和女性中分別是發(fā)病率第五和第七位的惡性腫瘤[13]，并且具有所有癌癥中第三高的死亡率[17]。該疾病的特征在于根治性切除術(shù)后的高復(fù)發(fā)率和對(duì)藥物治療的抵抗性。此外，由于缺乏準(zhǔn)確的早期診斷和有意義的治療，大多數(shù)HCC患者在診斷時(shí)處于晚期[18]，這導(dǎo)致大部分患者預(yù)后不良。因此，臨床醫(yī)生迫切需要用于診斷、預(yù)后和治療的新型候選生物標(biāo)志物。

研究表明[19]，CSN6作為COP9的復(fù)合體的亞基之一，它既構(gòu)成了COP9信號(hào)復(fù)合體的核心部件發(fā)揮作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中表達(dá)升高。而且CSN6在腫瘤中表達(dá)升高是具有其臨床意義的。在結(jié)腸癌中的研究中發(fā)現(xiàn)，CSN6在結(jié)腸癌組織中表達(dá)升高，而且高表達(dá)CSN6往往提示患者總生存期更短，基于多因素分析顯示，CSN6是結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素[20]。在惡性間質(zhì)瘤[10]和乳腺癌[21]的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)論。提示檢測(cè)CSN6的表達(dá)在指導(dǎo)腫瘤的臨床預(yù)后方面具有潛力。基于對(duì)CSN6在腫瘤細(xì)胞中的功能學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，CSN6在促進(jìn)腫瘤增殖[22]、侵襲和轉(zhuǎn)移[10]、抑制細(xì)胞凋亡[19]、誘導(dǎo)細(xì)胞周期進(jìn)展[23]等方面都具有重要作用，CSN6可以基于這些作用誘導(dǎo)腫瘤的惡性演進(jìn)。

在本研究中，基于公共數(shù)據(jù)庫(kù)信息和本中心臨床組織樣本我們首次證實(shí)，CSN6在肝細(xì)胞癌中表達(dá)升高，而且對(duì)于患者的預(yù)后具有提示作用?；诙鄠€(gè)公共數(shù)據(jù)庫(kù)的多樣本信息的交叉驗(yàn)證，提高了研究結(jié)果的準(zhǔn)確性，明確了CSN6在肝細(xì)胞癌中表達(dá)升高的現(xiàn)象。TCGA的數(shù)據(jù)分析顯示，CSN6在不同進(jìn)展程度和惡性程度患者腫瘤組織中存在表達(dá)差異，而且提示了CSN6在肝細(xì)胞癌患者中表達(dá)情況對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)作用。對(duì)本中心的樣本進(jìn)行的分析，再次驗(yàn)證了CSN6在肝細(xì)胞癌患者組織中的表達(dá)情況?；诟迂S富的臨床病理信息的驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)CSN6的表達(dá)與腫瘤分化程度和乙肝病毒感染具有相關(guān)性。這一結(jié)果的發(fā)現(xiàn)為CSN6在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)升高的意義和潛在機(jī)制的研究方向提供了一定指導(dǎo)。而且進(jìn)一步的分析證實(shí)，CSN6是影響肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。

綜上所述，本研究豐富了CSN6在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)和臨床意義的研究，證明了CSN6在肝細(xì)胞癌中表達(dá)升高并對(duì)肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后具有指導(dǎo)作用，為針對(duì)其作為肝細(xì)胞癌新的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的研究提供了證據(jù)。