普 睿 朱 琳 夏婷婷 畢皓然 孫鴻儒 黃 浩 張 磊 趙亞雙

大腸癌(Colorectal cancer，CRC)是常見的消化道惡性腫瘤之一，全球每年死于大腸癌的患者高達(dá)800 792人，其死亡率在死亡順位上排在第二位。在我國，大腸癌的死亡率位列全部腫瘤死亡率的第三位，大腸癌患者平均5年生存率僅為56.9%左右[1]。目前，影響大腸癌預(yù)后生存的因素主要包括遺傳學(xué)和表觀遺傳因素及臨床病理因素等，但機(jī)制尚不明確[2]。近年來，大量獨(dú)立的試驗(yàn)研究結(jié)果提示，特異性DNA甲基化可作為判斷大腸癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。JAK-STAT信號(hào)通路的異常激活會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期的失調(diào)，影響腫瘤細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移，影響患者的存活狀態(tài)[3]。

因此，本研究在239例大腸癌術(shù)后患者的隊(duì)列中檢測JAK-STAT通路主要基因STAT1及STAT3基因甲基化狀態(tài)并分析其與大腸癌預(yù)后的關(guān)系，并進(jìn)一步分析影響大腸癌患者的預(yù)后因素。

1 資料與方法

1.1 資料來源

收集2004年7月—2005年7月與2007年5月—2008年1月期間在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院接受手術(shù)治療的，經(jīng)病理確診為原發(fā)性散發(fā)大腸癌患者。入院后記錄患者的一般人口學(xué)資料及臨床病理資料，采集術(shù)前靜脈血液樣本5 mL，排除患者手術(shù)前進(jìn)行過放化療的病例、術(shù)后30天之內(nèi)死亡的病例。術(shù)后對(duì)患者每年進(jìn)行一次電話隨訪，記錄患者的生存情況，最后一次隨訪日期是2014年3月15日。總生存時(shí)間為患者接受手術(shù)后第一天直至死亡或失訪或到最后一次隨訪時(shí)間。死亡病例信息由家屬或相應(yīng)的聯(lián)系人提供。

1.2 研究方法

采用特異性高分辨率熔解曲線(MS-HRM)分析，通過與標(biāo)準(zhǔn)品熔解曲線比較位置和形狀間的差異，檢測特定基因的甲基化程度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Kaplan-Meier法計(jì)算生存時(shí)間，并繪制生存曲線，生存曲線的比較采用Log-rank檢驗(yàn)。應(yīng)用單因素及多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析STAT1，STAT3基因甲基化狀態(tài)以及臨床病理因素與大腸癌預(yù)后之間的關(guān)系，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般人口學(xué)資料

本研究共納入239名大腸癌患者，男性147例(61.50%)，女性92例(38.50%)，年齡25～78(56.60±11.60)歲，對(duì)全部研究對(duì)象隨訪，隨訪過程中124人(51.90%)存活，96人(40.20%)死亡，19人(7.90%)失訪，全部研究對(duì)象的基本特征見表1。

表1 研究對(duì)象的一般人口學(xué)特征

2.2 患者生存率

本研究納入239例大腸癌術(shù)后患者，中位總生存時(shí)間為83個(gè)月，1年生存率為94.90%，3年生存率為86.00%，5年生存率為67.20%(表2)。

表2 大腸癌患者不同性別、年齡、部位的生存率

2.3 影響大腸癌預(yù)后生存的單因素分析

2.3.1 STAT1，STAT3基因與大腸癌預(yù)后的單因素分析 經(jīng)Log-Rank檢驗(yàn)和Cox單因素分析顯示，STAT1，STAT3基因甲基化狀態(tài)與大腸癌預(yù)后總生存時(shí)間無關(guān)(圖1-2，表3)。

圖1 大腸癌患者外周血STAT1基因甲基化狀態(tài)與預(yù)后Figure 1 Methylation status and prognosis of STAT1 gene in peripheral blood of patients with colorectal cancer

圖2 大腸癌患者外周血STAT3基因甲基化狀態(tài)與預(yù)后Figure 2 Methylation status and prognosis of STAT3 gene in peripheral blood of patients with colorectal cancer

表3 STAT1，STAT3基因與大腸癌預(yù)后關(guān)系分析

2.3.2 臨床病理因素與大腸癌預(yù)后的單因素分析 將一般人口學(xué)資料和臨床病理因素納入單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型，結(jié)果顯示術(shù)中使用腸吻合器和Dukes分期可能與大腸癌患者預(yù)后有關(guān)(表4)。

表4 臨床病理因素與大腸癌預(yù)后關(guān)系的生存分析

2.4 影響大腸癌預(yù)后生存的多因素分析

將單因素分析存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的臨床病理學(xué)因素及STAT1和STAT3基因甲基化情況納入多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析。結(jié)果顯示，術(shù)中腸吻合器的使用和Dukes分期為大腸癌患者預(yù)后的影響因素，STAT1和STAT3基因甲基化狀態(tài)與大腸癌預(yù)后狀態(tài)無關(guān)(表5)。

表5 大腸癌預(yù)后生存的多因素生存分析

3 討論

近年來，雖然大腸癌的死亡率在全球范圍內(nèi)呈下降趨勢，但發(fā)展中國家大腸癌的死亡人數(shù)占全球的52%，且生存率徘徊在22.5%～65%[4]。馬來亞大學(xué)醫(yī)學(xué)中心(UMMC)進(jìn)行的一項(xiàng)雙向隊(duì)列研究表明與馬來人和印度人相比，中國患者的5年生存率最低[5]。研究大腸癌患者術(shù)后生存的影響因素，可作為臨床診治方案的參考，對(duì)于提升患者生命質(zhì)量有重要意義。

大腸癌的侵襲、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移是多步驟、多因素、多基因的復(fù)雜過程，每一階段都受多種基因/蛋白質(zhì)的調(diào)控。DNA甲基化主要發(fā)生在編碼基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島上，其可以通過抑制DNA與轉(zhuǎn)錄因子的識(shí)別與結(jié)合、促進(jìn)CpG結(jié)合蛋白向基因啟動(dòng)子區(qū)募集等機(jī)制抑制基因轉(zhuǎn)錄，使相應(yīng)的基因表達(dá)下調(diào)或不表達(dá)。一般來說，DNA甲基化程度越高，這段DNA被轉(zhuǎn)錄成RNA并翻譯成有功能蛋白質(zhì)的可能性就越小。JAK-STAT信號(hào)通路的異常激活導(dǎo)致細(xì)胞周期的失調(diào)，因而與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲等密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在大腸癌組織中JAK及STAT持續(xù)激活，而在正常上皮中缺失，同時(shí)結(jié)果顯示抑制JAK-STAT信號(hào)的活化能抑制腫瘤增殖和生長[6-9]。在微陣列免疫組織化學(xué)分析對(duì)414例大腸癌腫瘤樣本進(jìn)行的檢測中發(fā)現(xiàn)：高STAT1活性與患者總體存活率較高顯著相關(guān)，STAT3高表達(dá)與大腸癌患者總生存期增加約30個(gè)月相關(guān)，STAT3被確定為預(yù)測疾病結(jié)果的獨(dú)立因子[10]。另外，在104例晚期直腸癌中磷酸化STAT3(p-STAT3)的核免疫組化表達(dá)的研究中，結(jié)果顯示具有p-STAT3陽性的腫瘤的患者具有較高的總體存活率[11]。而IGF2BP3基因參與細(xì)胞生長和遷移，已被證明是一種參與癌癥發(fā)生發(fā)展的原癌基因，且甲基化狀態(tài)可作為指導(dǎo)結(jié)直腸癌分化和預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物[12]。JAK-STAT通路與其有相似的生物學(xué)作用，故本研究選擇JAK-STAT通路內(nèi)的STAT1和STAT3基因進(jìn)行甲基化的檢測。

本研究239例大腸癌患者切除術(shù)后5年生存率為67.20%。該結(jié)果與國內(nèi)蔡善榮等人報(bào)道842例大腸癌患者的5年生存率為66.30%以及與韓國Park等報(bào)道的2 230例大腸癌的5年生存率為67.20%相近[2，13]。

本研究結(jié)果顯示，性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大體分型、組織學(xué)分型、術(shù)后化療、STAT1以及STAT3基因甲基化狀態(tài)與大腸癌患者術(shù)后生存率無相關(guān)性。Dukes分期是反映腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的綜合指標(biāo)，許多研究已證實(shí)，Dukes分期是大腸癌預(yù)后的重要影響因素，生存率隨Dukes分期依次下降[14]。楊艷芳等人的研究結(jié)果顯示，Dukes分期每增加一期，其死亡風(fēng)險(xiǎn)即為上一期的3.06倍[15]。本研究顯示Dukes分期不僅是影響大腸癌預(yù)后的獨(dú)立因素，在多因素分析中也對(duì)患者生存期產(chǎn)生影響，與A期和B期患者相比，C期和D期患者死亡風(fēng)險(xiǎn)增加了0.33倍。由此我們推測，Dukes分期可作為推測大腸癌患者臨床結(jié)局的可靠指標(biāo)。

鮮有研究數(shù)據(jù)關(guān)于吻合器應(yīng)用對(duì)大腸癌治愈率和生存率的影響，我們的結(jié)果表明使用腸吻合器患者的5年生存率是74.60%，不使用腸吻合器患者的5年生存率是47.50%。已有資料顯示吻合器的廣泛應(yīng)用使低位直腸癌手術(shù)的保肛率增加，管狀吻合器在大腸癌合并梗阻時(shí)的應(yīng)用中，可縮短手術(shù)時(shí)間，減少深部操作的困難，減少并發(fā)癥的發(fā)生，提高生存率[16]。鄧純禹[17]對(duì)比了手工縫合治療和使用直腸吻合器的低位直腸癌前切除術(shù)患者共70例，經(jīng)生活質(zhì)量評(píng)分表調(diào)查顯示使用腸吻合器患者各項(xiàng)評(píng)分均優(yōu)于手工縫合治療患者，而且降低了術(shù)后吻合口漏的并發(fā)癥發(fā)生率，對(duì)于術(shù)者來說，使用腸吻合器也更加方便、安全，降低手術(shù)難度。據(jù)此我們推測，腸吻合器的使用通過提高患者術(shù)后生活質(zhì)量，從而影響到預(yù)后生存期，更多的資料和證據(jù)尚待進(jìn)一步研究。

本研究首次在中國人群中檢測外周血STAT1，STAT3基因甲基化狀態(tài)與大腸癌預(yù)后的關(guān)系，但尚未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，需要更大樣本的研究來證實(shí)。我們的研究結(jié)果顯示Dukes分期和術(shù)中腸吻合器的使用是影響大腸癌患者預(yù)后的重要因素，我們需要同時(shí)考慮腫瘤的大小、浸潤深度、分化程度、手術(shù)方法以及患者的健康水平等[18]。

綜上所述，大腸癌患者中Dukes分期為更高者死亡風(fēng)險(xiǎn)增加，術(shù)中使用腸吻合器患者預(yù)后優(yōu)于未使用者，外周血STAT1，STAT3基因甲基化狀態(tài)尚不能作為影響大腸癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物，仍需要更大樣本的深入研究。