周明學(xué) 李思耐 劉衛(wèi)紅 尚菊菊 劉紅旭

摘要：目的? 觀察丹紅注射液對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化（AS）小鼠自噬基因Atg13啟動(dòng)子區(qū)甲基化及自噬信號(hào)通路PI3K/Akt/mTORC1的影響，探討其可能的作用機(jī)制。方法? 40只8周齡雄性ApoE-/-小鼠高脂飼料喂養(yǎng)6周，隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和丹紅注射液低、高劑量組，每組10只，各給藥組給予相應(yīng)藥物干預(yù)。6周后RT-PCR檢測(cè)AS小鼠主動(dòng)脈自噬基因Atg13、Atg3和Atg4a的mRNA表達(dá);Western blot檢測(cè)AS小鼠主動(dòng)脈Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ、PI3K、Akt、p-Akt、mTORC1和p-mTORC1的蛋白表達(dá);采用亞硫酸氫鹽測(cè)序法檢測(cè)AS小鼠主動(dòng)脈自噬基因Atg13啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平。結(jié)果? 與模型組比較，丹紅注射液高、低劑量組小鼠主動(dòng)脈Beclin1蛋白表達(dá)明顯升高，丹紅注射液低劑量組小鼠主動(dòng)脈LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)明顯升高（P<0.01），丹紅注射液高、低劑量組小鼠主動(dòng)脈Atg13、Atg3和Atg4a mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.01），丹紅注射液高、低劑量組小鼠主動(dòng)脈自噬基因Atg13啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平明顯降低（P<0.01），丹紅注射液高、低劑量組小鼠主動(dòng)脈p-Akt蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.01），丹紅注射液高劑量組小鼠主動(dòng)脈p-mTORC1蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.01）。結(jié)論? 丹紅注射液防治AS的機(jī)制可能與降低模型小鼠主動(dòng)脈Atg13啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平、抑制PI3K/Akt/mTORC1信號(hào)通路和促進(jìn)細(xì)胞自噬有關(guān)。

關(guān)鍵詞：動(dòng)脈粥樣硬化;丹紅注射液;自噬;DNA甲基化;Atg13;PI3K/Akt/mTORC1信號(hào)通路;小鼠

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5??? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A??? 文章編號(hào)：1005-5304（2019）08-0046-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.08.010????? 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： Objective To study the effects of Danhong Injection on methylation of promoter region of autophagy gene Atg13 and autophagy signaling pathway PI3K/Akt/mTORC1 in atherosclerotic （AS） mice， to explore possible action mechanism. Methods Totally forty eight-week-old male ApoE-/- mice were fed with high-fat diet for 6 weeks. They were randomly divided into model group， positive control group， Danhong Injection low- and high-dosage groups （n=10）. The administration groups were given the corresponding drug for intervention. After 6 weeks， the mRNA expressions of the autophagy genes Atg13， Atg3 and Atg4a in AS mice were detected by RT-PCR; Western blot method was used to detect the protein expressions of Beclin1， LC3Ⅱ/Ⅰ， PI3K， p-Akt， mTORC1 and p-mTORC1 in the aorta of AS mice; Methylation level of the promoter region of autophagy gene Atg13 in the aorta of AS mice was detected by bisulfile sequencing PCR. Results Compared with model group， the protein expressions of Beclin1 in aorta of Danhong Injection groups significantly increased， LC3Ⅱ/Ⅰ expressions in aorta of Danhong Injection low-dosage group significantly increased （P<0.01）， and the mRNA expressions of Atg13， Atg3 and Atg4a in Danhong Injection groups also increased significantly （P<0.01）; The level of methylation of promoter region of autophagy gene Atg13 in Danhong Injection groups significantly decreased （P<0.01）， and the protein expressions of p-Akt in aorta of Danhong Injection groups significantly decreased （P<0.01）， the protein expressions of p-mTORC1 Danhong Injection in aorta of Danhong Injection groups high-dosage groups significantly decreased （P<0.01）. Conclusion The mechanism of Danhong Injection in preventing and treating AS may be related to decrease of methylation level of Atg13 in the promoter region in the aorta of model mice， reducing signaling pathway PI3K/Akt/mTORC1 and promoting autophagy.

Keywords： atherosclerosis; Danhong Injection; autophagy; DNA methylation; Atg13; signaling pathway of PI3K/Akt/mTORC1; mice

丹紅注射液是從紅花和丹參中提取純化制作而成的中藥復(fù)方制劑，具有通脈舒絡(luò)、活血化瘀功效，臨床上廣泛應(yīng)用于動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）性心腦血管疾病的治療，具有保護(hù)血管內(nèi)皮、抗炎、抗血栓、抗凋亡和神經(jīng)保護(hù)等藥理作用。我們既往研究結(jié)果表明，丹紅注射液明顯抑制AS，可能與DNA甲基化調(diào)控有關(guān)[1]，但具體機(jī)制尚不清楚。適度自噬對(duì)AS具有保護(hù)作用，通過(guò)自噬降解細(xì)胞內(nèi)受損結(jié)構(gòu)，以適應(yīng)炎癥、缺氧等環(huán)境改變[2]。DNA甲基化是AS發(fā)生的重要機(jī)制之一[3]，自噬基因及其相關(guān)信號(hào)通路基因出現(xiàn)甲基化修飾異常，可影響自噬，導(dǎo)致AS發(fā)生[4]。因此，本研究以高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠為觀察對(duì)象，觀察丹紅注射液對(duì)ApoE-/-小鼠AS主動(dòng)脈自噬標(biāo)志性基因和信號(hào)通路的干預(yù)作用，并通過(guò)檢測(cè)Atg13啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平，探討丹紅注射液抗AS可能的DNA甲基化機(jī)制。

1? 材料與方法

1.1? 動(dòng)物及飼料

6～8周齡ApoE-/-小鼠（品系C57BL/6J）40只，體質(zhì)量18～20 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于溫度20～26 ℃、相對(duì)濕度40%～70%環(huán)境，光照12 h明暗交替。高脂飼料配方為脂肪21%（W/W）、膽固醇0.15%西方類(lèi)型膳食飼料。

1.2? 藥物

丹紅注射液，山東丹紅制藥有限公司，批號(hào)16071028;阿托伐他汀鈣片，上海輝瑞制藥公司，批號(hào)017112K。

1.3? 主要試劑與儀器

Beclin1抗體（批號(hào)ab62557）、LC3Ⅱ蛋白激酶B抗體（批號(hào)ab48394）、PI3K抗體（批號(hào)ab182651）、AKT1抗體（磷酸化位點(diǎn)S473，批號(hào)ab18206）、mTORC1抗體（批號(hào)ab32028）、p-mTORC1抗體（Ser2448，批號(hào)ab109268），美國(guó)Abcam公司;甲基化DNA檢測(cè)試劑盒（批號(hào)CW2140）、DNA純化回收試劑盒（批號(hào)CW0524）、T載體連接試劑盒（批號(hào)CW0801），北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;qPCR試劑盒（KK4601），KAPABiosystems。SMA-1000分光光度計(jì)（美林恒通），JY300C電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司），K960PCR儀（杭州晶格科學(xué)儀器有限公司），實(shí)時(shí)定量PCR儀（ABI公司）。

1.4? 分組和給藥

實(shí)驗(yàn)小鼠高脂飼料飼養(yǎng)6周后，隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（3.34 mg/kg）和丹紅注射液高（6 mL/kg）、低（3 mL/kg）劑量組（丹紅高、低劑量組），每組10只。丹紅高、低劑量分別為臨床常用劑量的1、0.5倍，并按人與動(dòng)物給藥劑量換算系數(shù)折算成小鼠用量灌胃給藥[5]，陽(yáng)性對(duì)照組給予阿托伐他汀鈣片藥液灌胃（3.34 mg/kg），模型組給予等量生理鹽水灌胃;每日1次，連續(xù)6周;12周后脫頸處死小鼠，取主動(dòng)脈液氮驟冷，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5? RT-PCR檢測(cè)

分離總RNA，取2 μg RNA，使用第一鏈cDNA試劑盒在10.5 μL體系（50 U/μL RNA酶抑制劑0.5 μL、4 μL 5×buffer、2 μL dNTP MIX、2 μL DTT和1 μL AMV）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用Sybrpremix ex Taq試劑盒（Takara）擴(kuò)增，94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，共40個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸5 min。定量RT-PCR中使用特異性基因表達(dá)引物見(jiàn)表1。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)量化。以mGAPDH為內(nèi)參基因。

1.6? Western blot檢測(cè)

取小鼠主動(dòng)脈，試劑盒提取蛋白，采用BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度。6%～15% SDS聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行蛋白電泳，蛋白分離后恒定電流200 mA轉(zhuǎn)至PVDF膜。室溫5%脫脂奶粉封閉2 h，用相應(yīng)的一抗（1∶1000）4 ℃孵育過(guò)夜，洗滌后換HRP標(biāo)記二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h。洗滌后采用化學(xué)發(fā)光試劑盒在GE mageQuant LAS 4000 mini超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀顯影，Gel Image ststem ver.4.00對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。

1.7? 亞硫酸氫鹽測(cè)序法檢測(cè)

選擇Atg13啟動(dòng)子中富含CpG的區(qū)域測(cè)序。1 μg基因組DNA使用DNA甲基化試劑盒轉(zhuǎn)化的亞硫酸氫鹽。上游引物5'-TTTGAAGATTTTGATGTATAGA AATATT-3'，下游引物5'-ATTATTACCCTCAAAAATA AATACCT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度均為448 bp;使用MethPrimer（http：//www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/ methprimer.cgi）設(shè)計(jì)。用SK8141-PCR對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，克隆到pUC18-T載體系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)化為SK9307細(xì)胞。選擇獨(dú)立的白色菌落，并使用Genomelabgexp基因分析系統(tǒng)測(cè)序。采用亞硫酸氫鹽測(cè)序DNA甲基化分析軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。對(duì)各實(shí)驗(yàn)組中每個(gè)CpG位點(diǎn)的平均甲基化百分比進(jìn)行分析。

1.8? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用—x±s表示，組間比較方差齊時(shí)用方差分析，兩兩比較用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1? 丹紅注射液對(duì)模型小鼠主動(dòng)脈自噬標(biāo)志性基因LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1蛋白表達(dá)的影響

與模型組比較，丹紅高、低劑量組小鼠主動(dòng)脈Beclin1蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），丹紅低劑量組小鼠主動(dòng)脈LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），丹紅高劑量組小鼠主動(dòng)脈LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2? 丹紅注射液對(duì)模型小鼠主動(dòng)脈自噬基因Atg13、Atg3和Atg4a mRNA表達(dá)的影響

與模型組比較，丹紅高、低劑量組主動(dòng)脈小鼠自噬基因Atg13、Atg3和Atg4a mRNA表達(dá)均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3? 丹紅注射液對(duì)模型小鼠主動(dòng)脈自噬基因Atg13啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平的影響

與模型組比較，丹紅高、低劑量組小鼠主動(dòng)脈自噬基因Atg13啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平明顯降低（P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.4? 丹紅注射液對(duì)模型小鼠主動(dòng)脈PI3K/Akt/mTORC1信號(hào)通路的影響

與模型組比較，丹紅低、高劑量組小鼠主動(dòng)脈p-Akt蛋白表達(dá)明顯降低，丹紅高劑量組小鼠主動(dòng)脈p-mTORC1蛋白表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖4。

3? 討論

AS是心腦血管疾病發(fā)病的共同病理基礎(chǔ)，血脈瘀阻是心腦血管疾病的共同中醫(yī)病機(jī)?；钛鲋兴幍ぜt注射液治療AS體現(xiàn)了中醫(yī)“腦心同治”理論，見(jiàn)心病而兼治腦，見(jiàn)腦病同時(shí)兼顧心，符合中醫(yī)整體觀念異病同治思想，臨床上廣泛用于AS性心腦血管疾病的治療[6]。最新研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞異常自噬和基因的DNA甲基化修飾異常是AS發(fā)生的重要機(jī)制[7]。

自噬是細(xì)胞在自噬基因的調(diào)控下，利用溶酶體降解細(xì)胞內(nèi)受損細(xì)胞器及大分子物質(zhì)的過(guò)程。在AS病變?cè)缙?，通過(guò)自噬降解細(xì)胞內(nèi)受損結(jié)構(gòu)，以適應(yīng)炎癥、缺氧等環(huán)境改變，延緩AS發(fā)展[8]。Beclin1是細(xì)胞自噬的關(guān)鍵調(diào)控因子，是自噬體形成必需分子，可介導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白定位于吞噬泡，調(diào)控自噬體形成[9]。此外，微管相關(guān)蛋白前體LC3被裂解，產(chǎn)生一種活躍的細(xì)胞溶質(zhì)形式（LC3-Ⅰ），然后被催化和結(jié)合成LC3Ⅱ。LC3Ⅱ的相對(duì)量可反映自噬體的量，這種LC3亞型是目前最廣泛用來(lái)檢測(cè)自噬體的分子標(biāo)記[10]。呂燕妮等[11]應(yīng)用系統(tǒng)生物學(xué)方法模擬分析丹紅注射液中丹參與紅花配伍的分子機(jī)制，其機(jī)制可能主要在細(xì)胞自噬、脂質(zhì)代謝等生物學(xué)途徑上協(xié)同發(fā)揮防治疾病的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，丹紅注射液可明顯促進(jìn)AS小鼠主動(dòng)脈Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表達(dá)，以及自噬基因Atg13、Atg3和Atg4a的mRNA表達(dá)。提示促進(jìn)細(xì)胞自噬可能是丹紅注射液抑制AS的重要機(jī)制之一。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路是AS形成的重要信號(hào)傳導(dǎo)通路，該通路激活在自噬中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，mTOR活化后主要調(diào)控自噬基因Atg13表達(dá)[12]。我們研究結(jié)果提示，丹紅注射液可能通過(guò)抑制Akt在Ser473位點(diǎn)的磷酸化和mTORC1在Ser2448位點(diǎn)的磷酸化，抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的活性，從而促進(jìn)自噬基因Atg13的表達(dá)，促進(jìn)自噬，發(fā)揮抗AS作用。

既往活血化瘀抗AS作用機(jī)制研究主要集中在調(diào)脂、抗炎、保護(hù)細(xì)胞內(nèi)皮、降低血液黏稠度等方面，近年來(lái)，隨著基因組學(xué)和表觀遺傳研究在心血管研究領(lǐng)域的發(fā)展和深入，從DNA甲基化修飾為代表的表觀遺傳學(xué)角度來(lái)探討活血化瘀中藥的藥理機(jī)制，為研究活血中藥機(jī)制研究提供了新的思路與方法[13]。隨著DNA甲基化修飾與AS之間相關(guān)性的揭示，逆轉(zhuǎn)基因的異常甲基化成為治療AS的理想靶點(diǎn)。我們課題組既往研究表明，丹紅注射液可明顯降低AS小鼠血脂水平，減少AS斑塊面積，發(fā)揮抗AS作用，其機(jī)制可能與降低AS小鼠血清基因組甲基化水平、抑制AS小鼠血清學(xué)和主動(dòng)脈斑塊DNMT1表達(dá)有關(guān)[1]。提示丹紅注射液可明顯抑制AS，其機(jī)制與DNA甲基化調(diào)控有關(guān)。另有研究表明，DNMT1基因沉默后可明顯改善由振動(dòng)剪切刺激導(dǎo)致的血管內(nèi)皮功能紊亂，其機(jī)制與抑制PI3K/Akt/mTORC1信號(hào)通路的活化和誘導(dǎo)自噬有關(guān)[14]，提示抑制DNMT1參與調(diào)控細(xì)胞自噬，發(fā)揮抗AS作用。上述提示丹紅注射液抗AS的機(jī)制可能與調(diào)控自噬及相關(guān)通路有關(guān)。由于Atg13是自噬發(fā)生的關(guān)鍵基因，并受PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路調(diào)控，所以，本研究靶向Atg13的DNA甲基化修飾，探究丹紅注射液調(diào)控DNA甲基化干預(yù)AS的具體機(jī)制和干預(yù)環(huán)節(jié)。結(jié)果表明，丹紅注射液通過(guò)降低AS小鼠主動(dòng)脈Atg13啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平，促進(jìn)Atg13基因表達(dá)及自噬，防治AS的機(jī)制這一過(guò)程中還可能與抑制PI3K/Akt/ mTORC1信號(hào)通路活化有關(guān)。

綜上所述，丹紅注射液防治AS的機(jī)制可能與降低AS小鼠主動(dòng)脈Atg13啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平，抑制PI3K/Akt/mTORC1信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞自噬有關(guān)。具體機(jī)制尚需今后深入研究。

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（收稿日期：2019-03-19）

（修回日期：2019-04-11;編輯：華強(qiáng)）