葉侃 胡飛 魏兆軍

摘要分析米象代謝解毒相關(guān)基因谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）的表達，獲得米象基因遺傳信息，進而從本質(zhì)上全面揭示米象的磷化氫抗性。米象敏感品系經(jīng)磷化氫不同濃度熏蒸和不同時間熏蒸處理，2個基因經(jīng)LC30濃度磷化氫熏蒸的相對表達量顯著高于其他2個濃度；4個GSTs基因經(jīng)LC50濃度磷化氫熏蒸的相對表達量顯著高于對照組和LC30、LC10處理組；3個基因相對表達量均顯著低于對照組。7個GSTs基因隨著熏蒸時間的增加，相對表達量逐漸升高。米象GSTs基因在不同發(fā)育階段的相對表達模式中，SoGSTd1基因在四齡幼蟲階段的相對表達量最高；SoGSTe1基因在成蟲階段的相對表達量最高；SoGSTe2和SoGSTe5基因在四齡幼蟲階段的相對表達量最大，SoGSTe6基的相對表達量在三齡幼蟲階段最大。米象13個GSTs基因在不同組織部位的相對表達模式中。米象13個GSTs基因中的11個在中腸、脂肪體或馬氏管中的相對表達量均顯著高于頭部和表皮中的表達量。

關(guān)鍵詞 米象；谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶；磷化氫；基因表達

中圖分類號S433.5文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）08-0114-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.029

AbstractThrough transcriptome technology，several resistant genes related to S.oryzae such as glutathione Stransferase，cytochrome were analyzed and the transcriptome genetic information was obtained，revealing the resistance of insects in nature at transcriptome level is gaining a huge interest among the researchers.The S.oryzae sensitive strains of different concentrations of phosphine fumigation and fumigation treatment at different time were investiagted.The concentration of two genes was significantly higher than the other two concentrations by the concentration of LC30，and the relative expression of the four GSTs genes was significantly higher than that of the control group and the LC30，LC10 treatment group，and the relative expression of the three genes was significantly lower than that of the control group.The relative expression level of 7 GSTs genes increased gradually with the increase of fumigation time.The relative expression of the SoGSTd1 in the fourinstar stage was the highest in the relative expression pattern of the GSTs gene in the different developmental stages，and the relative expression of the SoGSTe1 gene in the adult stage was the highest.The relative expression of the SoGSTe2 and SoGSTe5 genes in the four instar stage was the largest，and the relative expression of the SoGSTe6 gene in the three instar larvae was maximum.13 GSTs genes of S.oryzae were differently expression in different tissues.The relative expression level of 13 GSTs genes in midgut，fat body or malpighian tubules in S.oryzae was significantly higher than that in the head and cuticle.The relative expression level of 11 genes in the midgut，fat body or malpighian tubules was higher than that in the head and cuticle.

Key wordsSitophilus oryzae；Glutathione Stransferases；Phosphine；Gene expression

米象（Sitophilus oryzae）屬于鞘翅目，象蟲科，是一種完全變態(tài)昆蟲。它有卵、幼蟲、蛹、成蟲4個發(fā)育形態(tài)，是貯藏谷物的主要害蟲之一，主要寄生在貯存2～3年的陳糧中，例如玉米、水稻、小麥、高粱等谷物中，成蟲在外部啃食谷物顆粒，幼蟲則寄生在谷物內(nèi)部蛀食[1]。由于其地理分布遍布全世界，生長繁殖速度快，因此對貯藏谷物危害嚴重[2]。在我國，米象主要生長在南方地區(qū)。

我國在1960年就為了防治儲糧害蟲，開始使用磷化氫熏蒸劑，由于磷化氫具有成本低、使用便捷、持續(xù)時間長、無明顯殘留以及對絕大多數(shù)害蟲、鼠類的殺蟲效果明顯等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用，至今仍沒有出現(xiàn)比它更高效的熏蒸劑替代物[3]。到了90年代中期，由于熏蒸劑磷化鋁的長期使用，一些儲糧害蟲產(chǎn)生了一定的磷化氫抗性[4]。根據(jù)調(diào)查，儲糧害蟲的磷化氫抗性品系從20世紀60年代的3種發(fā)展到31種，尤其在米象、谷蠹和扁谷盜中出現(xiàn)了對磷化氫的高抗性品種[5]，在印度發(fā)現(xiàn)的高抗性米象品系，其LC50已經(jīng)達1.7 mg/L（熏蒸20 h）[6]。我國研究人員于1988年測定了29種米象，其中12種具有抗性，抗性品種約占40%；1992年測定的37個品系中有26種為抗性品種，占比超過70%[7]。2004年對21種米象進行研究，13種米象被發(fā)現(xiàn)具有磷化氫抗性[8]。研究表明，2005年我國發(fā)現(xiàn)1種磷化氫抗性米象，LC50已經(jīng)達 6.313 mg/L，為敏感品系的1 034倍[9]。結(jié)合這些數(shù)據(jù)，說明米象產(chǎn)生抗藥的品種越來越多，并且抗藥性越來越強。

細胞色素P450、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和乙酰膽堿酯酶是昆蟲體內(nèi)的三大解毒酶。多年來，已開展了廣泛的抗性機制研究，結(jié)果表明昆蟲抗藥性的產(chǎn)生有不同的機制，已公認的包括對殺蟲劑暴露的減少、對殺蟲劑代謝的增強以及靶標部位敏感性的降低等[10]。

真核生物擁有多種谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）的不同催化活性，以適應(yīng)廣泛的酶家族功能[11]。生物體都具有一套精細的防御體系來抵抗外來和內(nèi)源有害物質(zhì)。在該體系中，GSTs的作用十分重要，它常在極端條件發(fā)揮抗氧化及解毒作用，從而對生物體起保護作用[12]。GSTs 的功能非常多樣，主要表現(xiàn)為以下3 個方面：①分解異源有毒物質(zhì)；②對細胞具有還原作用；③對內(nèi)源代謝物和外源化合物進行細胞間運輸[13]。

最早，GSTs是在大鼠中被發(fā)現(xiàn)具有活性[14]。近來，對于哺乳動物和昆蟲GSTs 的研究報道越來越多，并且對昆蟲GSTs 基因家族的結(jié)構(gòu)、功能和進化進行了綜述，如針對岡比亞按蚊（Anopheles gambiae），克隆得到其GSTs 基因28 個，并且已經(jīng)完成對其測序[15] 。在一些有機磷殺蟲劑產(chǎn)生抗性的家蠅中，發(fā)現(xiàn)了GSTs 水平上升[16]。研究GSTs與殺蟲劑抗性的關(guān)系對防治儲糧害蟲有重要的理論和實踐意義[17]。昆蟲GSTs的研究焦點主要集中于殺蟲劑抗性。在果蠅和家蠅中證實了GSTs基因與磷化氫抗性有關(guān)，按蚊中也發(fā)現(xiàn)了磷化氫抗性有關(guān)的基因，過量表達的重組按蚊GSTs基因產(chǎn)物在體外能催化磷化氫降解，大規(guī)模全基因組測序的完成使得果蠅和按蚊的GSTs研究迅速發(fā)展[18]。

目前已經(jīng)從二十多種昆蟲中克隆得到了近百個GSTs 基因序列。它們分別屬于至少3個類別：Ⅰ 類GSTs基因被劃分為Delta，屬于昆蟲特有的GSTs[19]。2007年，國內(nèi)發(fā)現(xiàn)了家蠶中1個由220個氨基酸組成的GST，其結(jié)構(gòu)與果蠅和按蚊中相似，同屬Delta類[20]；Ⅱ 類GSTs基因包括Theta、Sigma、Omega和Zeta類；Ⅲ 類GSTs 基因也是昆蟲特異性的，稱為Epsilon類。除了這三大類以外，有人認為果蠅中還存在第4類GSTs 基因[21]。此外，昆蟲GSTs 基因的表達調(diào)控也取得了初步進展。其中雙翅目昆蟲GSTs 基因水平的研究報道最多，其次是鱗翅目昆蟲，其他種類的昆蟲研究很少[22]。筆者分析了米象代謝解毒相關(guān)基因谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶的表達，獲得了米象基因遺傳信息，進而從本質(zhì)上全面揭示米象的磷化氫抗性。

1材料與方法

1.1供試昆蟲處理

1.1.1供試昆蟲。試驗所用的米象材料采集自河南工業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品儲藏實驗室。飼養(yǎng)條件為（27±1）℃，相對濕度為（70±5）%。將采集到的米象按不同的蟲態(tài)（卵、幼蟲、蛹、成蟲）分別放置，收集試蟲，每個蟲態(tài)收集300頭，裝入滅菌后的EP管中，放入-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。米象成蟲飼養(yǎng)于廣口瓶中，用棉布封口，以上述同樣條件在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以備進行后續(xù)試驗。

1.1.2磷化氫氣體的制備。磷化氫氣體是由磷化鋁與10%的稀硫酸反應(yīng)制備的，磷化氫濃度用鉬蘭比色法測定。磷化氫用密封式注射器注射入盛有試蟲的特制的真空干燥器中。

1.1.3抗性測定。使用聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）方法熏蒸處理20 h（25 ℃、70%RH）。處理的試蟲從干燥器中取出后放置在養(yǎng)蟲室內(nèi)飼養(yǎng)14 d，檢查死亡狀況，計算死亡率。

1.1.4受試米象的逆境處理。

1.1.4.1不同濃度磷化氫處理。用不同的熏蒸室，磷化氫濃度分別設(shè)置為LC50：0.039 mg/L、LC30：0.030 mg/L和LC10：0.005 mg/L，每種濃度設(shè)2 個平行。

1.1.4.2不同熏蒸時間處理。將磷化氫濃度統(tǒng)一設(shè)置為LC30：0.030 mg/L，熏蒸處理時間設(shè)置為12、24、36和48 h，每個時間設(shè)2個平行。

1.1.5數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)是用SPSS軟件進行分析處理和統(tǒng)計。

1.2米象轉(zhuǎn)錄組分析通過Solexa RNA 的paired-end 測序方法對各試驗樣品進行測序，將最短的reads片段從頭組裝成轉(zhuǎn)錄組。將得到的Unigene與數(shù)據(jù)庫中編碼已知功能蛋白的基因序列進行比對，鑒定出GSTs，細胞色素P450以及EST基因。

1.3RACE反應(yīng)獲得米象代謝解毒基因全長

1.3.1設(shè)計RACE引物。根據(jù)上一步獲得的米象代謝解毒基因部分中間片段，分別設(shè)計5′RACE和3′RACE特異性引物，擴增5′末端和3′末端全長序列，并預(yù)測長度。

1.3.2合成5′RACE和3′-RACE-Ready cDNA模板。為了獲得RACE-Ready cDNA模板，準備3′-RACE-Ready cDNA合成反應(yīng)體系，共需要2個反應(yīng)管，每管均為10 μL反應(yīng)體系。

米象13個GSTs基因在不同組織部位的相對表達模式如圖3所示。米象13個GSTs基因中的11個（SoGSTd1、SoGSTe1、SoGSTe2、SoGSTe3、SoGSTe4、SoGSTe5、SoGSTe6、SoGSTs1、SoGSTs2、SoGSTs3、SoGSTs4）在中腸、脂肪體或馬氏管中的相對表達量均顯著高于頭部和表皮中的表達量；SoGSTe6、SoGSTs2和SoGSTt2基因在表皮中的相對表達量最低；僅SoGSTt1基因在米象5種組織部位中的相對表達量均無顯著性差異。

3結(jié)論與討論

克隆獲得米象GSTs基因全長序列13個。根據(jù)序列的相似性和進化關(guān)系，將其中的6個基因歸類于Epsilon家族，4個基因歸類于Sigma家族，2個基因歸類于Theta家族，另歸類于Delta家族1個。米象GSTs基因中共鑒定出6個Epsilon家族的基因。米象GSTs基因中沒有鑒定出Omega、Zeta和Unclassified家族的基因。

米象敏感品系經(jīng)磷化氫不同濃度熏蒸和不同時間熏蒸處理。3個GST基因經(jīng)不同濃度的磷化氫熏蒸后的相對表達量均無顯著性差異；2個基因經(jīng)LC30濃度磷化氫熏蒸的相對表達量顯著高于其他2個濃度；4個GSTs基因經(jīng)LC50濃度的磷化氫熏蒸的相對表達量顯著高于對照組和LC30、LC10處理組；3個基因相對表達量均顯著低于對照組。GSTs從總體上來看，表達量受熏蒸時間和劑量的影響，且與時間、劑量呈正相關(guān)?？傮w上來說，隨著米象生長發(fā)育，GSTs表達量逐漸增加。

在不同組織部位上，中腸、脂肪體或馬氏管中的相對表達量均顯著高于頭部和表皮中的表達量。7個GSTs基因隨著熏蒸時間的增加，相對表達量逐漸升高；1個GSTs基因的相對表達量均顯著低于對照組。米象13個GSTs基因在不同組織部位的相對表達模式中。米象GST基因成蟲階段的相對表達量最高，在四齡幼蟲的相對表達量其次。

米象11個GSTs基因在中腸、脂肪體或馬氏管中的相對表達量均顯著高于頭部和表皮中的表達量。

通過對米象GST基因的分析，不僅發(fā)現(xiàn)了米象進化中的親緣關(guān)系，而且揭示了米象相關(guān)的抗藥性基因的分子機理，對抗性昆蟲產(chǎn)生的原理做出進一步闡釋，為新藥物的開發(fā)提供了指導(dǎo)。同時，擴充了米象的遺傳信息資源，為以后米象轉(zhuǎn)錄組的研究打下基礎(chǔ)。該研究選取米象中的GST基因進行系統(tǒng)分析，可以假設(shè)，建立抗性基因數(shù)據(jù)庫，一方面可以研究昆蟲的種間關(guān)系，另一方面，對綜合治理昆蟲抗藥性以及維持生態(tài)平衡都有積極的意義。

參考文獻

[1]劉暢，胡飛，魯玉杰，等.磷化氫熏蒸對米象抗性相關(guān)基因表達的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（15）：6881-6883.

[2] 唐培安，鄧永學(xué)，王進軍.甲酸乙酯對米象乙酰膽堿酯酶和羧酸酯酶的影響[J].植物保護，2007，33（1）：44-47.

[3] 謝尊逸，賈寶琦，何鳳琴.米象對磷化氫抗性機理的初步研究[J].糧食儲藏，1986，14（4）：1-7.

[4] 梁權(quán).迎接害蟲磷化氫抗性的挑戰(zhàn)[J].糧食儲藏，1994，23（1）：3-7.

[5] 李雁聲，李文質(zhì)，黎萬武，等.谷蠹和米象對磷化氫抗性遺傳的研究[J].昆蟲學(xué)報，1994，37（3）：271-279.

[6] RAJENDRAN S.Insect resistance to phosphne：Challenges and strategies[J].International pest control，2001，43（3）：118-123.

[7] GEORGHIOU G P，TAYLOR C E.Operational influences in the evolutiong of insecticide resisitance[J].J Econ Ent，1977，70（5）：653-658.

[8] 嚴曉平，黎萬武，劉作偉，等.我國主要儲糧害蟲抗性調(diào)查研究[J].糧食儲藏，2004，32（4）：17-19.

[9] 曹陽.我國儲糧害蟲玉米象和米象磷化氫抗藥性調(diào)查[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2005，26（5）：1-5.

[10] SCOTT J G.Cytochrome P450 monooxygenases and insecticide resistance：Lessons from CYP6D1[M]//ISHAAYA I.Biochemical sites of insecticide action and rsistance.New York：Springer，2001：255-259.

[11] ORTELLI F，ROSSITER L C，VONTAS J，et al.Heterologous expression of four glutathione transferase genes genetically linked to a major insecticide-resistance locus from the malaria vector Anopheles gambiae[J].Biochemical journal，2003，373（Pt 3）：957-963.

[12] 馮雪，王彬，孫艷香.谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶的研究進展[J].生物學(xué)教學(xué)，2012，37（6）：5-6.

[13] FENG Q L，DAVEY K G，PANG A S D，et al.Glutathione Stransferase from the spruce budworm，Choristoneura fumiferana：Identification，characterization，localization，cDNA cloning，and expression[J].Insect biochemistry & molecular biology，1999，29（9）：779-793.

[14] FENG Q L，DAVEY K G，PANG A S D，et al.Developmental expression and stress induction of glutathione Stransferase in the spruce budworm，Choristoneura fumiferana[J].Journal of insect physiology，2001，47（1）：1-10.

[15] SHEEHAN D，MEADE G，F(xiàn)OLEY V M，et al.Structure，function and evolution of glutathione transferases：Implications for classification of non-mammalian members of an ancient enzyme superfamily[J].Biochem J，2001，360（Pt 1）：1-16.

[16] VONTAS J G，SMALL G J，HEMINGWAY J.Glutathione S-transferases as antioxidant defence agents confer pyrethroid resistance in Nilaparvata lugens[J].Biochemical journal，2001，357（Pt 1）：65-72.

[17] 余泉友，房守敏，左偉東.家蠶谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因BmGSTz1的克隆、序列分析及組織表達特征[J].昆蟲學(xué)報，2010，53（10）：1061-1068.

[18] RANSON H，ROSSITER L，ORTELLI F，et al.Identification of a novel class of insect glutathione S-transferases involved in resistance to DDT in the malaria vector Anopheles gambiae[J].Biochemical journal，2001，359（Pt 2）：295-301.

[19] BOARD P G，BAKER R T，CHELVANAYAGAM G，et al.Zeta，a novel class of glutathione transferases in a range of species from plants to humans[J].Biochemical journal，1997，328：929-935.

[20] 左偉東，余泉友，李斌，等.家蠶谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因的克隆、序列分析及其表達模式[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2007，15（4）：595-601.

[21] DING Y C，ORTELLI F，ROSSITER L C，et al.The Anopheles gambiae glutathione transferase supergene family：Annotation，phylogeny and expression profiles[J].BMC Genomics，2003，4（1）：35-36.

[22] 陳鳳菊，高希武.昆蟲谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的基因結(jié)構(gòu)及其表達調(diào)控[J].昆蟲學(xué)報，2005，48（4）：600-608.