翟連鎖，李琳，趙桂芳

（濟(jì)南市濟(jì)陽(yáng)區(qū)人民醫(yī)院，山東 濟(jì)南 251400）

骨具有強(qiáng)大的修復(fù)、再生功能，在骨折愈合過(guò)程中，成骨細(xì)胞主要合成骨基質(zhì)，起著非常重要的作用。TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子具有多種生物學(xué)功能，在骨折愈合中是很強(qiáng)的骨吸收刺激因子，可以促使破骨細(xì)胞分化形成。此外，有大量研究顯示，TNF-α、IL-6會(huì)抑制成骨細(xì)胞，進(jìn)而影響骨折的愈合，但是其確切機(jī)制還未研究清楚。串珠素（也叫基底膜蛋白多糖）可影響細(xì)胞和基質(zhì)間的粘附，在軟骨發(fā)育、血管生成中起著非常重要的作用，有研究顯示串珠素還可促進(jìn)神經(jīng)纖維的修復(fù)。在骨折愈合時(shí)，成骨細(xì)胞會(huì)表達(dá)一定的串珠素，串珠素有利于骨折的愈合[1]。本次研究以期通過(guò)研究一定濃度的TNF-α、IL-6對(duì)體外培養(yǎng)胎鼠成骨細(xì)胞中串珠素mRNA表達(dá)的影響，找出一種抑制成骨細(xì)胞活動(dòng)的機(jī)制，加以干預(yù)，促進(jìn)骨折愈合的治療。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：10只新生SD大鼠（24 h）。實(shí)驗(yàn)試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、RT-PCR試劑盒、0.25%胰蛋白酶等。實(shí)驗(yàn)儀器：CO2培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、PCR儀等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 通過(guò)酶消化方法提取胎鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在6孔培養(yǎng)板中，以105/mL密度接種傳代培養(yǎng)的第3代成骨細(xì)胞，每孔100 mL細(xì)胞懸液，在37oC下培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為3組（6孔/組）：A組加入等量細(xì)胞培養(yǎng)液；B組加入10 ng/mL TNF-α；C組加入100 ng/mL IL-6。在24 h、48 h、72 h時(shí)，收集每孔細(xì)胞，根據(jù)RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)中步驟提取總RNA，使用特異性引物進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄，最后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并通過(guò)Quantity one軟件測(cè)定擴(kuò)增條帶的灰度值，計(jì)算灰度比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 通過(guò)SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

在10 ng/mL TNF-α、100 ng/mL IL-6干擾下，24 h、48 h、72 h胎鼠成骨細(xì)胞串珠素表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1 對(duì)比分析各組細(xì)胞串珠素mRNA灰度比（Mean±SD）

3 討論

機(jī)體中有TNF-α、IL-1/6等骨吸收刺激因子，作用靶目標(biāo)為破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞，不僅會(huì)影響成骨細(xì)胞的活性，還會(huì)促使破骨細(xì)胞活性的增加[2]。所以，如果骨吸收刺激因子的表達(dá)過(guò)度，會(huì)使得喪失骨質(zhì)多于形成的骨質(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生，大幅度增加了骨折的發(fā)生率；此外，還會(huì)使得骨折愈合時(shí)間延長(zhǎng)，嚴(yán)重的情況下可能會(huì)導(dǎo)致骨折不愈合的問(wèn)題。大量研究顯示，TNF-α、IL-1/6等骨吸收刺激因子可促進(jìn)破骨前體細(xì)胞的分化，激活NF-kB通路，反作用于TNF-α、IL-1/6，增加其表達(dá)量。

目前對(duì)骨吸收刺激因子的研究主要集中在破骨細(xì)胞的代謝、分化以及增殖等方面，有關(guān)對(duì)成骨細(xì)胞影響的研究比較少。TNF-α可抑制成骨細(xì)胞活性，但是其機(jī)制非常復(fù)雜，目前還未研究清除。在人體中，TNF-α受體是一種對(duì)抗成骨細(xì)胞強(qiáng)化因子的介質(zhì)，TNF-α?xí)种乒腔|(zhì)合成、成骨細(xì)胞分化，進(jìn)而抑制骨形成。此外，細(xì)胞凋亡是TNF-α介導(dǎo)抑制的重要通路之一。相關(guān)研究表明，在一定濃度TNF-α作用下，成骨細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡壞死。有研究人員通過(guò)大鼠實(shí)驗(yàn)研究了骨折愈合過(guò)程中TNF-α的變化情況，結(jié)果顯示骨折部位牽引會(huì)影響骨痂的形成，部分骨組織中TNF-α表達(dá)量顯著上升，可影響骨折的愈合。有研究人員對(duì)吸煙對(duì)骨折愈合中TNF-α的表達(dá)進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示吸煙會(huì)使TNF-α表達(dá)量增加，進(jìn)而使得骨折愈合時(shí)間延長(zhǎng)。臨床上，有研究人員發(fā)現(xiàn)骨折、手術(shù)創(chuàng)傷會(huì)使得患者體內(nèi)TNF-α、IL-6表達(dá)顯著增加，并且隨著創(chuàng)傷時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)量慢慢減小。在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)生中，IL-6因子起著非常重要的作用。上述研究均在一定程度上表明了骨折愈合中，TNF-α、IL-6起著非常重要的作用，然而大部分是以大鼠、小鼠等為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在細(xì)胞水平上的研究比較少。

人體中，TNF-α、IL-6是非常重要的炎癥因子，過(guò)度表達(dá)會(huì)造成MODS，也是導(dǎo)致創(chuàng)傷、燒傷等患者死亡的重要因素[3]。臨床上，已經(jīng)開(kāi)始使用IL-1受體拮抗劑、腫瘤壞死因子單抗等炎癥介質(zhì)類藥物治療SIRS過(guò)度反應(yīng)造成的MODS上，但是其實(shí)際療效還需要深入研究。在骨折不愈合患者中，TNF-α、IL-6等的表達(dá)顯著升高，會(huì)影響骨折的愈合。目前，有關(guān)TNF-α、IL-6對(duì)骨折愈合的影響主要集中在破骨細(xì)胞方面，對(duì)成骨細(xì)胞（特別是分子水平）的研究相對(duì)較少。目前，已經(jīng)有研究對(duì)串珠素、骨折不愈合間的關(guān)系進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示在骨折愈合中，串珠素起著非常重要的作用，會(huì)對(duì)骨折愈合產(chǎn)生一定的影響。在骨折愈合中，IL-6、IL-1、TNF-α之間是協(xié)同還是拮抗作用依然需要深入地研究，在臨床上可尋找一條新的道路，找出影響骨折愈合的一種因素，進(jìn)而為骨折不愈合的治療提供新的治療方法。