張民秀，謝芝勛*，謝志勤，高約，謝麗基，劉加波，鄧顯文，羅思思，張艷芳，曾婷婷

(1.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所 廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室, 南寧 530001； 2.英國倫敦大學(xué)瑪麗女王學(xué)院, 英國倫敦 E1 4NS)

Ⅰ群禽腺病毒(Fowl adenovirus group Ⅰ, FAdV-Ⅰ)屬于腺病毒科禽腺病毒屬，該病毒廣泛存在于雞、鴨、鵝等多種禽類的呼吸道和消化道中。根據(jù)FAdV-Ⅰ的核酸序列特征和血清交叉中和試驗結(jié)果，將FAdV-Ⅰ分為5個種群(FAdV-A、FAdV-B、FAdV-C、FAdV-D和FAdV-E)和12個血清型[1]，根據(jù)研究學(xué)者的報道，目前引起雞群心包積水-肝炎綜合征(Hydropericardium hepatitis syndrome, HHS)主要多見于FAdV-C的血清4型(FAdV-4)，而FAdV-E中的血清8b型(FAdV-8b)和FAdV-D中的血清11型(FAdV-11)主要引起雞包涵體肝炎(Avian Inclusion Body Hepatitis, IBH)[2-3]，此外FAdV-E中的FAdV-8b也可以引起肌胃糜爛癥((Adenoviral gizzard erosion, AGH)[3-4]，2006年Okuda證實FAdV-A也能導(dǎo)致AGH[5]。

六鄰體(Hexon)蛋白是FAdV-Ⅰ的主要結(jié)構(gòu)蛋白，該蛋白呈三聚體形式，三聚體的每個hexon 分子包含兩個保守的基座區(qū)(P1和P2)和四個高變環(huán)(loop1、loop 2、loop 3 和 loop 4)，其中l(wèi)oop 1 基因常常被研究者用于基因分析和血清分型[6-7]。自2014年以來，中國部分地區(qū)的雞群爆發(fā)了大范圍FAdV-4的感染，造成雞群大量死亡[3,8]。本研究于2017年11月-2018年12月采集了廣西某規(guī)模化雞場不同日齡健康雞群的咽喉拭子和泄殖腔拭子4700份，從FAdV-Ⅰ陽性樣品中擴增FAdV-Ⅰ的hexon蛋白 loop 1基因序列并進行測序和序列分析，以期獲得該規(guī)模化雞場健康雞群感染FAdV-Ⅰ的情況，為進一步豐富FAdV-Ⅰ的分子流行病學(xué)和FAdV-Ⅰ病的有效控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及處理 2017年11月-2018年12月于廣西某規(guī)模化雞場采集不同日齡(1日齡～300日齡以上)健康蛋種雞群(品種：花雞)的咽喉拭子和泄殖腔拭子4700份(咽喉拭子和泄殖腔拭子均放置于同一個EP管，該樣品視為一份樣品)：使用2 mL PBS緩沖溶液浸泡樣品，作用2 h，反復(fù)凍融3次，3000 r/min離心10 min，取上清液并-70 ℃保存?zhèn)溆?，每一次采樣?shù)為雞舍內(nèi)雞群飼養(yǎng)量的1%。

1.2 主要試劑 DH5α感受態(tài)細胞，分子克隆所需試劑盒EasyPure Genomic DNA kit和膠回收試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；TaKaRaExTaq和pMD18-T購自Takara公司；1500 bp ladder購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物 用于樣品檢測FAdV-Ⅰ和擴增hexon蛋白loop 1基因的引物參考文獻[9]，F(xiàn)AdV-1：5’-GACATGGGGTCGACCTATTTCGACAT-3’，F(xiàn)AdV-2：5’-AGTGATGACGGGACATCAT-3’，目的片段大小為728 bp，引物由華大基因生物科技(深圳)有限公司合成。

1.4 樣品DNA的提取 取樣品上清液200 μL按照EasyPure Genomic DNA kit的操作說明書提取咽喉拭子和泄殖腔拭子樣品中的DNA，于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 FAdV-Ⅰ hexon蛋白 loop 1基因的擴增及序列分析 按照EasyPure Genomic DNA kit的說明書提取 FAdV-Ⅰ 陽性樣品的DNA。參照TaKaRaExTaq操作說明進行 loop 1基因的擴增。PCR產(chǎn)物進行電泳純化后按照常規(guī)操作進行基因克隆，挑取陽性克隆菌液送上海立菲生物技術(shù)公司進行測序。測序所得結(jié)果在NCBI (National Center for Biotechnology Information) 上的Nucleotide Blast(Nucleotide Basic Local Alignment Search Tool)工具進行鑒定，并利用LaserGene7.1和Molecular Evolutionary Genetics Analysis4.1(MEGA4.1)對hexon蛋白 loop 1 基因的核苷酸同源性進行分析，從GenBank上獲得12條FAdV-Ⅰhexon基因序列，其中血清1型(FAdV-1)(JQ647514)、血清2型(FAdV-2)(KT862806)和血清3型(FAdV-3)(KC750797)各一條，F(xiàn)AdV-8b(GU734104和KC750780)、血清5型(FAdV-5)(KC750798和KC750799)和FAdV-4 (KT899325和HE608152)各兩條，剩余三條為血清8a型(FAdV-8a)(KC750786、KC750801和KT862810)，本研究使用美國分類方法對 FAdV-Ⅰ的血清型進行分型，參考牛登云等[9]的研究構(gòu)建hexon蛋白 loop 1基因遺傳進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同日齡健康雞群FAdV-Ⅰ的感染情況 采集1～35日齡雞群的咽喉拭子和泄殖腔拭子525份，40～70日齡的雞群樣品575份，71～99日齡的雞群樣品為550份，100日齡至淘汰的雞群樣品為3050份，健康雞群陽性FAdV-Ⅰ的總檢出率為8.72%。如圖1所示，40～70日齡雞群陽性FAdV-Ⅰ的檢出率為28.17%，71～99日齡、1～35日齡雞群和100日齡至淘汰的雞群FAdV-Ⅰ的檢出率分別為22.91%、0.76%和3.90%。

圖1 不同日齡健康雞群FAdV-Ⅰ的感染情況Fig 1 Infections of FAdV-Ⅰin differentages of healthy chickens

2.2 hexon蛋白loop 1基因的擴增結(jié)果和FAdV-Ⅰ種的鑒定 隨機選取FAdV-Ⅰ陽性樣品38份，擴增hexon 蛋白loop 1基因，擴增產(chǎn)物大小約為728 bp(圖2)。陽性克隆菌經(jīng)測序并將測序結(jié)果通過NCBI 上的Nucleotide Blast工具鑒定后發(fā)現(xiàn)，38條hexon 蛋白loop 1基因序列包含5個種群(圖3)，其中26.32%(10/38)的序列為FAdV-A(血清1型)、2.63%(1/38)為FAdV-B(血清5型)、10.53%(4/38)為FAdV-C(血清4型)、39.47%(15/38)為FAdV-D(分別為血清2型和3型)和21.05%(8/38)為FAdV-E(分別為血清8a和8b型)。

圖2 Loop 1基因擴增結(jié)果Fig 2 The amplification result of loop 1 gene

圖3 FAdV-Ⅰ 不同種的占比情況Fig 3 The proportion of different species of FAdV-I

2.3 FAdV-Ⅰhexon蛋白loop 1基因同源性分析和遺傳進化分析 分別將不同種loop 1基因進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)本研究中不同種FAdV-Ⅰloop 1基因之間同源性較低，F(xiàn)AdV-A的loop 1基因核苷酸序列之間的同源性為97.8%～99.6%，F(xiàn)AdV-C的核苷酸同源性為93.2%～98.2%；FAdV-D的核苷酸同源性為72.7%～99.8%，其中血清2型的核苷酸同源性為94.1%～99.0%，血清3型核苷酸同源性為95.9%～99.8%；FAdV-E的核苷酸同源性為81.4%～99.7%，其中血清8a型的核苷酸同源性為98.8%～99.7%，血清8b型的核苷酸同源性為94.5%～98.4%。將本研究中獲得的38條FAdV-Ⅰ loop 1基因序列進行遺傳進化分析，分析結(jié)果顯示如表1和圖4所示，本研究中的FAdV-Ⅰ 可分為5個種，分別是FAdV-A、FAdV-B、FAdV-C、FAdV-D和FAdV-E，含有7個血清型，分別是FAdV-1、FAdV-2、FAdV-3、FAdV-4、FAdV-5、FAdV-8a和FAdV-8b，其中優(yōu)勢種為FAdV-D，血清2型為優(yōu)勢血清型，F(xiàn)AdV-A(血清1型)和FAdV-E(分別為血清8a和8b)次之。

3 討論與結(jié)論

FAdV-Ⅰ廣泛存在于雞群中，F(xiàn)AdV-Ⅰ中的FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11可以導(dǎo)致雞出現(xiàn)包涵體肝炎和心包積水-肝炎綜合征[3, 10]，近幾年來我國部分地區(qū)的雞群陸續(xù)出現(xiàn)以肝臟壞死和心包積液為特征的雞包涵體肝炎和心包積水-肝炎綜合征，死亡率可高達30%，對雞的養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[1,3,9]。目前國內(nèi)關(guān)于對健康雞群感染FAdV-Ⅰ的研究較少，本研究對廣西某健康雞群FAdV-Ⅰ的感染情況進行調(diào)查，鑒別當(dāng)前雞群感染FAdV-Ⅰ的血清型，這對及時應(yīng)對FAdV-Ⅰ的發(fā)生和控制具有重要意義。

圖4 FAdV-Ⅰhexon蛋白loop 1基因遺傳進化樹Fig 4 The phylogenetic tree of loop 1 gene of hexon protein of FAdV-Ⅰ

表1 FAdV-Ⅰhexon蛋白loop 1基因序列信息Tab 1 The information about the loop 1 genes ofhexon protein of FAdV-Ⅰ

Yates等[11]研究表明，雞在感染腺病毒后第3周會排毒，后備母雞在感染腺病毒后第5～9周排毒量達到高峰，14周后仍有70%的陽性雞群在排毒。本研究對不同日齡蛋種雞群采集的4700份樣品的咽喉拭子和泄殖腔拭子進行FAdV-Ⅰ的檢測，發(fā)現(xiàn)40～70日齡和71～99日齡雞群FAdV-Ⅰ的檢出率均高于1～35日齡和100日齡以上的雞群，分別達28.17%和22.91%，F(xiàn)AdV-Ⅰ在40～70日齡高檢出率也說明這個階段日齡是FAdV-Ⅰ排毒高峰，這與Yates等人的研究相符。此外，本研究中71～99日齡的FAdV-Ⅰ的檢出率仍然很高，因此推測FAdV-Ⅰ的排毒高峰期可能更長，但這需要通過動物試驗進一步證實；本研究中40～99日齡雞群FAdV-Ⅰ的高感染率也再次證實了健康雞群FAdV-Ⅰ感染的普遍性。

FAdV-Ⅰ分為5個種共有12個血清型：FAdV-A(FAdV-1)、FAdV-B(FAdV-5)、FAdV-C(FAdV-4和FAdV-10)、FAdV-D(FAdV-2、FAdV-3、FAdV-9和FAdV-11)、FAdV-E(FAdV-6、FAdV-7、FAdV-8a和FAdV-8b)[1]。王小輝等[12-13]2008年對湖南、新疆等地的活禽市場和養(yǎng)殖場的健康雞群的FAdV-Ⅰ進行檢測和分離，發(fā)現(xiàn)FAdV-Ⅰ的陽性率高達51.4%，所有分離株均屬于血清1型。羅思思等[14]于2008-2010年對從廣西活禽市場上采集的樣品進行FAdV-Ⅰ的檢測，F(xiàn)AdV-Ⅰ陽性率達35.5%，分離株hexon基因遺傳進化分析發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢血清型均為1型。本研究對獲得的38條hexon蛋白 loop 1基因進行基因分析，發(fā)現(xiàn)該雞場的健康雞群感染了5個種的FAdV-Ⅰ，其中39.47%的序列為FAdV-D(主要為FAdV-2和FAdV-3)并且遺傳進化分析也表明該雞場健康雞群感染的優(yōu)勢種群為FAdV-D，F(xiàn)AdV-2為優(yōu)勢血清型，F(xiàn)AdV-A(FAdV-1)次之，因此推測目前健康雞群感染的FAdV-Ⅰ的優(yōu)勢血清型和種可能發(fā)生了變化， 隨著FAdV-D(FAdV-2)感染的病例增多，主導(dǎo)種群可能由FAdV-A(FAdV-1)轉(zhuǎn)變成FAdV-D(FAdV-2)，但本研究數(shù)據(jù)只展示了某個規(guī)?；u場的數(shù)據(jù)，還需要收集更多的來源不同的FAdV-Ⅰhexon基因序列進行下一步研究。機體感染病毒的表現(xiàn)和結(jié)局由病毒、機體和環(huán)境相互作用所決定，其中病毒的致病性和毒力是感染結(jié)局的主要決定因素[15]。本研究在健康雞群中監(jiān)測到FAdV-Ⅰ中的 FAdV-2、FAdV-4和FAdV-8b的感染。有研究表明FAdV-2和FAdV-8b型可以引起包涵體肝炎，F(xiàn)AdV-4可以引起心包積水-肝炎綜合征[1]，但在本研究中感染了這些血清型的雞群外表均呈現(xiàn)健康的狀態(tài)，并未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，這可能是由于該健康雞群所感染的FAdV-Ⅰ的致病力和毒力較弱因而不能引起雞群發(fā)病，因此有必要下一步對病毒進行分離并通過后續(xù)的動物試驗進行證實。有研究表明禽類以自然感染或直接傳播的方式感染FAdV-Ⅰ時，均未導(dǎo)致機體發(fā)生疾病，但將這些FAdV-Ⅰ毒株以非腸道途徑注射感染時，機體會出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，研究還發(fā)現(xiàn)當(dāng)FAdV-Ⅰ與雞傳染性貧血和傳染性法氏囊病病毒混合感染時，某些FAdV-Ⅰ的分離株致病力會增強，直接導(dǎo)致機體發(fā)生肝炎或致死[1, 16-17]，這也揭示了FAdV-Ⅰ致病機制的復(fù)雜性。

本研究于2017年11月-2018年12月對廣西某規(guī)?；u場健康蛋種雞群FAdV-Ⅰ的感染進行了分子流行病學(xué)調(diào)查，為了解健康雞群感染FAdV-Ⅰ的情況、豐富FAdV-Ⅰ的分子流行病學(xué)和FAdV-Ⅰ病的有效控制提供了參考依據(jù)。