李天增，潘曉梅，張偉，師小瀟，徐龍飛，賀筍

(天康生物股份有限公司，烏魯木齊830032)

豬圓環(huán)病毒病 (Porcine circovirus disease，PCVD) 是由豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)引起的豬傳染性疾病，自1997年Clark等首次分離PCV2以來，該病已給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。目前，PCV2在我國豬群中普遍存在，能夠引起免疫抑制、混合感染和繼發(fā)感染，嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[1-3]。

PCV2屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬，病毒無囊膜，病毒粒子直徑約為17 nm，基因組為單鏈環(huán)狀DNA，大小為l767 bp或1768 bp，有11個閱讀框，其中ORF1和ORF2是最主要的閱讀框。ORF2大小為702 bp，編碼233個氨基酸，是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白(核衣殼蛋白)[4]，具有良好的免疫原性，是構(gòu)建重組疫苗和檢測的首選基因，目前已在不同系統(tǒng)中得到有效表達[5-7]。因此，本試驗利用昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)對PCV2-rCap蛋白優(yōu)化表達進行了研究，以期為今后開發(fā)PCV2亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 重組病毒株 重組病毒株vBac-SP-PCV2由天康生物股份有限公司構(gòu)建和保存。High-five 細胞購自Invitrogen公司。

1.2 試劑 Ni-NTA Purification System為Invitrogen公司產(chǎn)品；蛋白預(yù)染Marker購自Thermo Fisher 公司；辣根過氧化物酶標記兔抗豬二抗購自Sigma公司；豬源PCV2多克隆抗體由天康生物股份有限公司制備。TEMED購白北京鼎國生物技術(shù)有限公司；咪唑為SIGMA公司產(chǎn)品，其他試劑為進口或國產(chǎn)分析純試劑。

2 方 法

2.1 vBac-SP-PCV2表達條件的優(yōu)化

2.1.1 High five細胞濃度的確定 用SFX培養(yǎng)基將High five細胞濃度調(diào)整為1.0×106/mL、1.5×106/mL、2.0×106/mL、3.0×106/mL，每瓶總量100 mL，分別加入2 MOI病毒感染量重組桿狀病毒，細胞置于26～28 ℃培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，分別于接毒后24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h、192 h、216 h、240 h定時取樣，每次收集5 mL細胞混懸液。

2.1.2 病毒感染量和蛋白表達時間的確定 用SFX培養(yǎng)基將High five細胞濃度調(diào)整為2×106/mL，總量100 mL，分別加入0.25、0.5、1、1.5、2、3 MOI病毒感染量重組桿狀病毒，細胞置于26～28 ℃培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，分別于接毒后24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h、192 h、216 h、240 h定時取樣，每次收集5 mL細胞混懸液。

2.2 表達產(chǎn)物的分析 將以上收取樣品于4 ℃以10000 r/min離心10 min，收集表達后細胞沉淀，加入裂解液，于冰浴中進行超聲破碎10 min(功率200 W，1/2探頭，破碎30 s，間歇30 s)，超聲結(jié)束后于4 ℃以12000 r/min離心10 min，分別取上清進行Western blotting分析。

2.3 重組蛋白的純化和濃縮 將大批表達PCV2-rCap蛋白的細胞液以10000 r/min離心10 min收集細胞沉淀，超聲破碎，離心收集上清，用His Bind Purification Fits進行純化。將細胞裂解物10～15 mL加入準備好的含有8 mL填料的純化柱中。4 ℃輕柔振蕩結(jié)合過夜，以保持細胞裂解產(chǎn)物能始終混懸填料。靜止，讓Ni-NTA瓊脂糖填料靠重力的作用自己沉降完全澄清。放出上清液，上清液取樣。將30 mL PBS加入純化柱中，不斷輕柔換向扣敲純化柱混懸Ni-NTA瓊脂糖。靜止，讓Ni-NTA瓊脂糖填料靠重力的作用自己沉降完全澄清。放出上清液，PBS洗脫2次。上清液取樣存放于4 ℃進行SDS-PAGE分析。固定好柱子，使用5 mL的洗脫液洗脫蛋白。收集1 mL的洗脫液用于SDS-PAGE分析, BCA法檢測蛋白濃度。

2.4 Cap蛋白純化濃縮產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western blotting分析 取蛋白樣品60 μL與20 μL 4×上樣buffer混合，進行SDS-PAGE及Western blotting分析。然后將SDS-PAGE膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，置含5%的脫脂奶粉的PBST中，4 ℃封閉30 min，清洗，加入稀釋1∶500倍一抗豬源PCV2多克隆抗體，4℃緩慢振蕩過夜；清洗，加入稀釋1∶5000倍含辣根過氧化物酶標記的兔抗豬的二抗，室溫作用1 h，清洗，于暗室內(nèi)進行顯色。

2.5 純化蛋白的電鏡觀察 將純化濃縮蛋白吸取3 μL鋪在經(jīng)特殊處理的噴碳的銅網(wǎng)上，1 min后用濾紙吸干，用5%磷鎢酸pH7.0負染1 min，干燥后用電子顯微鏡進行觀察蛋白分子形狀。

2.6 純化的PCV2-rCap免疫原性試驗 純化蛋白配制疫苗，免疫豚鼠，以相同劑量相同方式分別進行二次免疫。免疫后每周采血，離心取血清，采用IFA檢測PCV2 Cap蛋白抗體效價。56 ℃水浴槽30 min。在PCV2抗原盤蓋子上寫好標示。將所有孔加入75 μL 3% PBA。在第1排每孔加入25 μL血清樣品 (第1排血清稀釋倍數(shù)為4倍)。之后為連續(xù)4倍稀釋血清。第12排為陰性空白對照孔(PCV2陰性血清樣本)。置于4 ℃感作12 h。去除一抗后，每孔加入200 μL的PBST，洗板4次。將每孔的PBST倒干后，每孔加入以1% PBA 稀釋二抗Goat anti mouse FITC 50 μL，置25 ℃感作4 h。去除二抗后，每孔加入200 μL的PBST，洗板 4次。將每孔的PBST倒干后，再加入50 μL PBST，并于倒立熒光顯微鏡下判讀熒光細胞。

3 結(jié)果與分析

3.1 最佳蛋白表達條件的確定

3.1.1 最佳High five細胞濃度的確定 重組PCV2-rCap蛋白表達試驗，按2MOI接種病毒時，當細胞密度不低于2.0×106/mL，培養(yǎng)時間為168 h，蛋白含量最高。

3.1.2 最佳病毒感染量和蛋白表達時間的確定 以2.0×106/mL High five細胞濃度，不同病毒感染量、蛋白表達時間進行蛋白表達條件優(yōu)化，根據(jù)不同的接毒量和表達時間表達的重組PCV2-rCap蛋白(細胞沉淀超聲后上清)Western blotting AlphaEaseFC軟件灰光度值分析結(jié)果，篩選出表達量相對較高的0.25 MOI(168 h和192 h)、0.5 MOI(192 h和216 h)、1 MOI(168 h)、1.5 MOI(168 h)、2 MOI(144 h)、3 MOI(168 h)8個桿狀病毒表達的重組PCV2-rCap蛋白，進行下一步的最佳接毒量和表達時間的篩選試驗。由圖1 AlphaEaseFC軟件灰光度值分析結(jié)果：確定2.0×106/mL High five細胞濃度、1.5 MOI病毒感染量、蛋白表達時間168 h為重組PCV2-rCap蛋白表達的最佳條件。

3.2 重組蛋白的純化和濃縮 將細胞沉淀超聲破碎離心收集上清用His Bind過柱純化，收集洗脫液進行Western blotting分析，圖2結(jié)果表明，在純化濃縮液中蛋白條帶大小與重組蛋白吻合，說明重組蛋白已經(jīng)得到純化，且純度較高。

3.3 純化重組蛋白用于Western blotting中蛋白質(zhì)定量分析 BCA法檢測純化蛋白濃度約1 mg/mL。Western blotting中蛋白質(zhì)定量分析，稀釋的標準蛋白采用軟件線性擬合曲線分析R2=0.99，在可信度范圍(R2≥0.95)之內(nèi)，可用于蛋白定量分析。

3.4 純化PCV2-rCap蛋白的電鏡觀察 PCV2b ORF2基因編碼蛋白經(jīng)昆蟲細胞表達系統(tǒng)表達后具有正常的結(jié)構(gòu)和功能，能夠形成病毒樣顆粒，大小均勻，直徑為20 nm左右(圖3)。

圖3 純化濃縮重組蛋白的病毒樣顆粒圖(100nm)Fig 3 Virus-like particle diagram of purifiedrecombinant protein concentration (100nm)

3.5 純化的PCV2-rCap免疫原性試驗 純化蛋白配制疫苗，免疫豚鼠，免疫7日后即有抗體產(chǎn)生，免疫21日后所有豚鼠抗體均轉(zhuǎn)陽，免疫28日抗體達到較高水平(圖4、圖5)，表明蛋白的免疫原性好，能高效誘導(dǎo)機體產(chǎn)生良好的體液免疫。

圖4 IFA檢測PCV2陽性血清抗體結(jié)果(彩圖)Fig 4 IFA detection of PCV2 positive serumresults (color map)

4 討論與結(jié)論

桿狀病毒表達系統(tǒng)為高效表達外源蛋白表達體系，目的蛋白在昆蟲細胞內(nèi)能夠正確折疊、二硫鍵的搭配及寡聚物的形成，表達產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)及功能上接近天然蛋白[8]。病毒感染復(fù)數(shù)、病毒感染時間、細胞密度等是影響桿狀病毒表達系統(tǒng)為高效表達的關(guān)鍵因素[9-10]，因此本研究對影響桿狀病毒表達系統(tǒng)為高效表達的關(guān)鍵因素進行探討研究優(yōu)化。結(jié)果顯示，當細胞密度不低于2.0×106/mL時，隨著病毒感染復(fù)數(shù)增加到一個臨界值1.5MOI后，蛋白表達量不再增加；隨著病毒感染時間延長，蛋白表達量不斷增加，168 h為峰值，192 h蛋白表達量略有下降，進一步說明病毒感染復(fù)數(shù)和病毒感染時間是影響蛋白表達量的重要因素。

圖5 免疫豚鼠PCV2抗體結(jié)果分析圖Fig 5 Results of immune guinea pigPCV2 antibody analysis

本研究利用昆蟲細胞桿狀病毒表達系統(tǒng)表達了Cap蛋白，電鏡觀察顯示形成了病毒樣顆粒，同時在重組蛋白的C末端設(shè)計了His.tag序列，外源基因與組氨酸標簽融合表達，為重組蛋白的純化創(chuàng)造了條件[11-12]，提高了純化效率，同時不會因為插入組氨酸標簽影響外源基因蛋白的活性，為進一步研發(fā)豬圓環(huán)病毒的亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。

蛋白百分比定量方法定量是基于普通的蛋白電泳，目的蛋白處有可能有降解的蛋白沉降此處，會導(dǎo)致蛋白定量偏高。而Western blotting分析是指將蛋白質(zhì)樣品經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上，然后用抗體通過免疫學(xué)反應(yīng)檢測目的蛋白，是抗原抗體的特異性反應(yīng)[13]，因此本試驗的定量更為準確。