馮二凱，易立，羅國良，王振軍，郭利，陳立志，程世鵬，程悅寧*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春 130112； 2.吉林特研生物技術(shù)有限責(zé)任公司，長春 130122)

犬瘟熱(canine distemper，CD)是犬瘟熱病毒(Canine distemper virus，CDV)感染引起的、可導(dǎo)致多種食肉動物患病的一種急性、接觸性傳染病[1]，可感染所有的犬科、鼬科以及水生哺乳動物，且感染宿主范圍正在不斷擴大[2-3]。不同動物對CDV的易感性和致死率各不相同，從30%～80%不等，對我國的養(yǎng)犬業(yè)，毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)和野生珍稀動物保護造成了很大危害。

犬瘟熱臨床防治沒有治療藥物，只能通過疫苗接種免疫預(yù)防。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所先后研究了我國第一代和第二代水貂犬瘟熱活疫苗，疫苗的成功研制為有效控制我國毛皮動物犬瘟熱疫情的發(fā)生和流行奠定了基礎(chǔ)。為了適應(yīng)毛皮動物飼養(yǎng)業(yè)對高品質(zhì)生物制品的需求，提升企業(yè)產(chǎn)品的市場競爭力，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所又開展了水貂犬瘟Vero細胞活疫苗(CDV3-CL株，懸浮培養(yǎng))的懸浮培養(yǎng)工藝的開發(fā)工作。

本研究在前期建立犬瘟熱Vero細胞活疫苗(CDV3-CL株，懸浮培養(yǎng))懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)工藝的基礎(chǔ)上[4-6]，利用建立的疫苗懸浮制備工藝生產(chǎn)3批疫苗半成品，實驗室根據(jù)《新獸藥研制管理辦法》、《獸用生物制品注冊分類及注冊資料要求》的有關(guān)規(guī)定，制備了三批水貂犬瘟熱Vero細胞活疫苗(CDV3-CL株，懸浮培養(yǎng))，在疫苗檢驗合格的基礎(chǔ)上對疫苗的安全性進行了系統(tǒng)評價。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 種毒與細胞 非洲綠猴腎細胞(Vero)，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所保存；犬瘟熱CDV3-CL毒株第15代(基礎(chǔ)毒種)，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所鑒定和保存。

1.1.2 試驗用疫苗 安全性試驗用3批犬瘟熱Vero活疫苗(CDV3-CL株，懸浮培養(yǎng))凍干品(批號：201701、201702、201703)，由吉林特研生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，規(guī)格為15頭份/瓶，2017年1月份制備，疫苗在-20 ℃以下條件下保存。

1.1.3 微載體混懸液(5 g/L) 取已硅化藍蓋瓶，稱5 g微載體，按照100 mL/g微載體的比例加入無Ca2+、Mg2+的PBS，于4 ℃浸泡過夜；次日棄PBS和漂浮微載體，按200 mL/g微載體的比例加入無Ca2+、Mg2+的PBS，120 ℃高壓滅菌30 min，冷卻至室溫備用。

1.1.4 細胞維持液 含有2%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，用于接毒后病毒增殖。

1.1.5 試驗動物 品系：美國短毛黑；2～4月齡和8～10月齡水貂以及妊娠30～35 d水貂(中和抗體SN≤1∶4)，由吉林中特農(nóng)業(yè)科技有限公司異獸路分公司提供。安全試驗動物選擇健康，未接種任何疫苗的水貂。

1.2 方法

1.2.1 疫苗檢驗 參照農(nóng)業(yè)部第2215號公告[7]要求，對3批疫苗進行質(zhì)量檢驗，質(zhì)量檢驗由吉林特研生物技術(shù)有限責(zé)任公司質(zhì)量管理部完成。

1.2.2 試驗動物 本試驗對2～4月齡水貂幼崽、8～10月齡育成水貂和妊娠30～35 d水貂進行安全性測試。試驗動物管理按正常條件進行飼養(yǎng)管理；水貂均為單籠飼養(yǎng)，分組試驗。

1.2.3 疫苗安全性評價指標 包括全身性和局部安全檢查。全身性檢查包括體溫監(jiān)測、精神狀態(tài)、食欲變化、幼獸生長性能、妊娠水貂是否流產(chǎn)等；局部檢查包括注射部位有無炎癥或破潰、局部吸收情況等。

1.2.4 單劑量皮下接種安全性試驗 3批疫苗分別接種2～4月齡和8～10月齡水貂，10只/組，后肢內(nèi)側(cè)皮下接種，1頭份/只，接種后連續(xù)觀察14 d，觀察全身和接種局部變化；接種后10 d內(nèi)每日記錄體溫變化。第15 d剖殺水貂，檢查接種部位有無病理變化。

1.2.5 單劑量重復(fù)皮下接種安全性試驗 3批疫苗分別接種2～4月齡水貂進行單劑量重復(fù)接種試驗，10只/組，后肢內(nèi)側(cè)皮下接種，1頭份/只，兩次接種時間間隔14 d，二次接種后繼續(xù)觀察全身和接種局部變化；重復(fù)接種后10 d內(nèi)，每日記錄體溫變化。

1.2.6 超劑量皮下接種安全性試驗 3批疫苗分別接種2～4月齡水貂進行試驗；10只/組，后肢內(nèi)側(cè)皮下接種，10頭份/只，分四點注射，接種后連續(xù)觀察14 d，觀察全身和接種局部變化，接種后10 d內(nèi)，每日記錄體溫變化。第15天剖殺水貂，檢查接種部位有無病理變化。

1.2.7 微載體安全性試驗 將制備的微載體混懸液(5 g/L)接種水貂幼崽和育成水貂，考察微載體對水貂的安全性，5只/組，后肢內(nèi)側(cè)皮下接種，1.0mL/只，分兩點注射，接種后連續(xù)觀察14d，觀察全身和接種局部變化，并在接種后10 d內(nèi)，每日記錄體溫變化。第15天剖殺水貂，檢查接種部位有無病理變化。

1.2.8 妊娠水貂安全性試驗 3批疫苗分別接種妊娠30～35 d水貂進行安全性試驗。每組試驗接種水貂10只，后肢內(nèi)側(cè)皮下接種，1頭份(毫升)/只，接種后觀察至產(chǎn)仔后1個月，記錄妊娠水貂是否出現(xiàn)流產(chǎn)。

1.2.9 對照組 每個實驗組設(shè)置對照組，水貂注射細胞維持液，5只/組，注射劑量、方式與上述試驗同步進行。

1.2.10 組織病理切片分析 在每組試驗的末期(第15天)，剖殺2只水貂，觀察接種部位有無炎癥或破潰；取接種部位肌肉，甲醛固定后，經(jīng)HE染色后，觀察各實驗組動物接種部位組織病理變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 犬瘟熱Vero細胞活疫苗(CDV3-CL株，懸浮培養(yǎng))質(zhì)量檢驗結(jié)果 三批犬瘟熱Vero細胞活疫苗(CDV3-CL株，懸浮培養(yǎng))無菌檢驗、外源病毒檢驗均為陰性，表明3批疫苗質(zhì)量均符合標準，可以用于臨床安全性評價試驗；疫苗凍干后每頭份病毒含量為103.80～104.00TCID50/0.1 mL(表1)。

表1 三批犬瘟熱Vero細胞活疫苗(CDV3-CL株，懸浮培養(yǎng))檢驗結(jié)果Tab 1 The inspection result of three batch of CDV vaccine(CDV3-CL strain，suspension)

“-”表示檢測結(jié)果陰性

2.2 一次單劑量皮下接種安全性試驗結(jié)果 3批疫苗接種水貂幼崽(2～4月齡)及育成水貂(8～10月齡)，通過14 d觀察，接種10 d內(nèi)各組水貂平均體溫變化正常(未連續(xù)2 d超過40.5 ℃)(圖1和圖2)；水貂食欲、糞便及精神狀態(tài)均正常，接種局部無腫脹和炎癥，未出現(xiàn)局部和全身炎癥反應(yīng)(表2和表3)。

圖1 疫苗對水貂一次單劑量接種后體溫變化圖(2～4月齡)Fig 1 The fluctuate curve of body temperature ofmink received one dose vaccine(2～4 month)

圖2 疫苗對水貂一次單劑量接種后體溫變化圖(8～10月齡)Fig 2 The fluctuate curve of body temperature ofmink received one dose vaccine(8～10 month)

表2 疫苗對水貂一次單劑量接種安全性試驗統(tǒng)計結(jié)果(2～4月齡)

表3 疫苗對水貂一次單劑量接種安全性試驗統(tǒng)計結(jié)果(8～10月齡)Tab 3 The security test record of one dose vaccine inoculation (8～10 month)

“-”代表水貂被打皮，未統(tǒng)計

2.3 單劑量重復(fù)皮下接種安全性試驗結(jié)果 3批疫苗接種2～4月齡水貂幼崽，間隔14 d重復(fù)接種1次，通過14 d觀察，接種水貂10 d內(nèi)平均體溫未超過40.5 ℃(圖3)；水貂食欲、糞便和精神狀態(tài)均正常，接種局部無腫脹和炎癥，未出現(xiàn)局部和全身反應(yīng)(表4)。

2.4 超劑量皮下接種安全性試驗結(jié)果 3批疫苗超劑量接種2～4月齡水貂幼崽，通過14 d觀察，實驗組水貂10 d內(nèi)平均體溫未超過40.5℃；3批疫苗接種后2～3 d內(nèi)，水貂會出現(xiàn)體溫短暫升高到40.5 ℃以上情況(圖4)；水貂糞便和精神正常，疫苗接種局部無腫脹和炎癥，未出現(xiàn)局部和全身反應(yīng)(表5)。

圖3 疫苗單劑量重復(fù)接種水貂體溫變化圖Fig 3 The fluctuate curve of body temperature of minkreceived single dose repeat inoculation of vaccine

圖4 疫苗超劑量接種水貂后體溫測定結(jié)果Fig 4 The fluctuate curve of body temperature ofmink received overdose of vaccine

表4 疫苗單劑量重復(fù)接種安全性試驗結(jié)果

表5 疫苗超劑量接種水貂安全性試驗結(jié)果

2.5 單劑量妊娠水貂安全性試驗結(jié)果 3批試驗疫苗皮下接種30～35日齡妊娠水貂，通過臨床觀察，接種水貂食欲、糞便和精神狀態(tài)均正常，觀察至產(chǎn)仔，未出現(xiàn)流產(chǎn)，產(chǎn)后胎兒發(fā)育未發(fā)現(xiàn)異常(表6)，說明疫苗對妊娠水貂具有較好的安全性。

2.6 微載體安全性評價試驗結(jié)果 微載體接種水貂幼崽(2～4月齡)后，接種10 d內(nèi)各組水貂平均體溫變化正常，與對照組沒有顯著區(qū)別(圖5)；水貂食欲、糞便及精神狀態(tài)均正常，接種局部無腫脹和炎癥，未出現(xiàn)局部和全身炎癥反應(yīng)(表7)。

表6 疫苗對妊娠水貂安全性試驗結(jié)果Tab 6 The security test record of pregnancy mink received one dose of vaccine

圖5 微載體接種水貂后體溫測定結(jié)果Fig 5 The fluctuate curve of body temperature of mink received of microcarrier

組別水貂數(shù)/只水貂年齡接種途徑體溫變化精神食欲接種局部變化生長性能發(fā)病和死亡/只微載體52～4月齡皮下正常正常無正常0對照52～4月齡皮下正常正常無正常0

2.7 疫苗接種部位組織病理切片觀察 疫苗接種后，無論是對照組還是實驗組，接種部位皮下均無異常變化，僅見顏色與周圍皮膚略有不同，未見炎癥反應(yīng)。病理切片觀察發(fā)現(xiàn)，接種部位的肌肉組織排列規(guī)整、肌纖維整齊、橫紋肌明顯，未見變性、壞死及炎性細胞浸潤(圖6)。

圖6 接種部位組織病理切片觀察Fig 6 The histopathology change of the inoculation site of mink

3 討論與結(jié)論

無論是人用疫苗，還是獸用疫苗，安全和有效是其兩大基本特性。因此，任何一個新疫苗在研發(fā)階段或者推向市場之前，必須要開展疫苗的安全性評價。例如在我國發(fā)生小反芻獸疫(Peste destits ruminants virus，PRRV)疫情后，為了確保疫區(qū)外動物安全，我國批準利用PRR Nigerja 75/1疫苗株制造疫苗，并接種羊和豚鼠、小鼠進行了免疫接種，評價疫苗安全性[8-9]。崔艷麗等[10]在研制了雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感(H9亞型)四聯(lián)滅活疫苗(LaSota株+HS25株+HZ株)后，也在本動物上開展了安全性評價。本研究為了盡快將利用懸浮培養(yǎng)工藝研制的水貂犬瘟熱Vero細胞活疫苗(CDV3-CL株，懸浮培養(yǎng))推向市場，在本動物上(水貂)開展了疫苗的安全性評價。

根據(jù)農(nóng)業(yè)部442號[11]公告中獸藥變更注冊事項及申報資料要求，改變獸藥生產(chǎn)工藝，其生產(chǎn)工藝的改變不應(yīng)導(dǎo)致藥用物質(zhì)基礎(chǔ)的改變。因此需要對新工藝研發(fā)的疫苗臨床試驗。為了全面評價犬瘟熱Vero細胞活疫苗(CDV3-CL株，懸浮培養(yǎng))的安全性，參照農(nóng)業(yè)部683號[12]公告中《獸用生物制品實驗室安全試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》要求，本研究選擇不同年齡的水貂(包括幼崽(2～4月齡)、育成水貂(8～10月齡)、妊娠水貂(30～35 d))進行安全性實驗。實驗分3組進行，每組10只水貂，采用單劑量(1頭份)皮下接種、單劑量重復(fù)皮下接種(1頭份)、超劑量(10頭份)皮下接種動物進行安全性試驗。結(jié)果表明，接種水貂全身和局部未見異常臨床反應(yīng)，對幼貂發(fā)育無不良影響，體溫波動范圍處于正常范圍，說明疫苗具有較好的安全性。疫苗接種妊娠水貂未見有流產(chǎn)和死亡發(fā)生，進一步說明了疫苗的安全性。此外，為了驗證培養(yǎng)介質(zhì)(微載體)在動物體內(nèi)的安全性，在單劑量安全性實驗組中設(shè)置微載體安全性評價組，通過觀察動物臨床表現(xiàn)、監(jiān)測體溫變化，未發(fā)現(xiàn)異常，說明微載體對實驗動物安全性無明顯影響，這也是微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于人和動物新工藝開發(fā)的重要原因[4,13-14]。

綜上所述，基于懸浮工藝制備的水貂犬溫?zé)酼ero細胞活疫苗(CDV3-CL株，懸浮培養(yǎng))凍干品，具有很高的安全性，可以用于臨床防治水貂犬瘟熱疾病。