銀慧慧，劉偉，趙武，孟菲，姜源明，覃振華，孫建華

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，南寧 530001)

桃金娘[Rhodomyrtustomentosa(Ait.) Hassk.]，又名稔子樹、豆稔等，是一種優(yōu)良的野生藥用植物資源[1-3]，我國臺灣、福建、廣西、廣東以及云南等南方地區(qū)較為常見，在日本、菲律賓、印度以及馬來西亞等國家也有分布。桃金娘全株可入藥，具有除濕祛風(fēng)、去瘀止血、止痛等功效，在《獸藥國家標準(化學(xué)藥品、中藥卷)第一冊》(中國獸藥委員會，2013)中已收錄了桃金娘根，而其他部位尚未有統(tǒng)一標準。桃金娘果實中富含黃酮、多酚以及多糖等多種活性成分，在飲料、釀酒以及保健品等方面都逐漸得到了開發(fā)應(yīng)用[4-6]。桃金娘果中已知的酚類物質(zhì)有沒食子酸(Gallic acid, GA)、鞣花酸(Ellagic acid, EA)、白皮杉醇(Piceatannol, PICE)和白藜蘆醇(Resveratrol, RES)等[7-8]。目前，對于這4種酚類物質(zhì)的檢測方法主要有紫外分光光度法(UV)[9]、高效液相色譜法(HPLC)[10]和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS)[11-12]等。UV法較為繁瑣，靈敏度低，重現(xiàn)性差；而HPLC法同時測定多種酚類物質(zhì)耗時較長，試劑消耗大；HPLC-MS法雖然靈敏度和準確度高，但檢測費用較高、普及率低。基于前期基礎(chǔ)，研究建立了一種快速、簡便分離測定桃金娘果中沒食子酸、鞣花酸、白皮杉醇、白藜蘆醇的超高效液相色譜法(UPLC)，為桃金娘果藥材質(zhì)量標準的制定提供科學(xué)依據(jù)，促進野生桃金娘資源得到更有效的開發(fā)和利用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Waters Acquity UPLC帶二級管陣列檢測器(PDA)，EmpowerTM3色譜工作站，配Waters CORTECS?UPLC?T3色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)(美國waters公司)；SK7200HP型超聲波清洗器(上海科導(dǎo))；Milli-Q超純水儀(Millipore公司)。

沒食子酸對照品(中國食品藥品檢定研究所，110831-201204，含量89.9%)；鞣花酸對照品(中國食品藥品檢定研究所，111959-201602，含量89.3%)；白皮杉醇對照品(北京索萊寶科技有限公司，10083-24-6，HPLC≥98%)；白藜蘆醇對照品(中國食品藥品檢定研究所，110877-201703，含量99.4%)；0.2 μm混合濾膜(美國waters公司)；桃金娘干果(產(chǎn)地廣東梅州、廣西桂林和廣西柳州，經(jīng)廣西植物研究所溫放副研究員鑒定為桃金娘的干燥果實)；實驗用試劑均為色譜純，實驗用水均為超純水。

1.2 方法

1.2.1 UPLC檢測條件 色譜柱：Waters CORTECS?UPLC?T3色譜柱(2.1 mm×100 mm， 1.6 μm)；流動相：乙腈-0.2%磷酸；梯度洗脫條件：0～2 min， 6%乙腈；2～4 min，6%～20%乙腈；4～10 min，20%～60%乙腈；10～12 min，6%乙腈；檢測波長：280 nm；流速：0.2 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣體積5 μL。

1.2.2 標準溶液的配置 準確稱取沒食子酸、鞣花酸、白皮杉醇、白藜蘆醇對照品置于不同棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別制成沒食子酸濃度為98.7 μg/mL、鞣花酸濃度148 μg/mL、白皮杉醇濃度121 μg/mL、白藜蘆醇濃度90.2 μg/mL的對照品溶液；實驗時，分別用甲醇依次稀釋配制成不同濃度的標準工作液，過0.2 μm濾膜后使用。

1.2.3 供試品溶液配置 將桃金娘干果打粉，過篩，得到的樣品粉末置烘箱中烘干至恒重，置干燥器中儲存；準確稱取1.0 g桃金娘果粉末置于具塞錐形瓶中，準確加入30 mL甲醇，稱定重量，超聲(350 W，53 kHz，40 ℃)提取40 min，放冷，補重，過濾，置于棕色容量瓶中保存，過濾膜。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜行為 吸取一定量含沒食子酸濃度為49.4 μg/mL、鞣花酸濃度74.0 μg/mL、白皮杉醇濃度60.6 μg/mL、白藜蘆醇濃度45.1 μg/mL的混合對照品溶液，按1.2.1節(jié)色譜條件，在190～400 nm進行紫外波長掃描，得到的紫外光譜圖如圖1所示。沒食子酸、鞣花酸、白皮杉醇、白藜蘆醇對照品溶液和桃金娘干果(廣西桂林)供試品溶液的色譜圖分別見圖2、圖3，在1.2.1節(jié)的梯度洗脫條件下，沒食子酸、鞣花酸、白皮杉醇、白藜蘆醇能夠與樣品基質(zhì)較好分離。

A. 沒食子酸; B. 鞣花酸; C. 白皮杉醇; D.白藜蘆醇圖1 對照品紫外光譜圖Fig 1 The ultraviolet spectrogram of reference substance

A. 沒食子酸; B. 鞣花酸; C. 白皮杉醇; D.白藜蘆醇圖2 對照品色譜圖Fig 2 Chromatograms of reference substance

1. 沒食子酸; 2. 鞣花酸; 3. 白皮杉醇; 4.白藜蘆醇圖3 桃金娘果樣品色譜圖Fig 3 Chromatogram of Rhodomyrtus tomentosa(Ait.) Hassk. fruit sample

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 方法線性范圍 分別精密吸取不同濃度的沒食子酸、鞣花酸、白皮杉醇、白藜蘆醇對照品溶液進行UPLC測定，以得到的色譜峰峰面積(y)為縱坐標，相應(yīng)的濃度(x)為橫坐標，繪制4種酚類物質(zhì)的標準曲線。當(dāng)沒食子酸、鞣花酸、白皮杉醇、白藜蘆醇濃度在一定范圍時，具有良好的線性關(guān)系(r>0.9996，如表1所示)。

表1 線性方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍Tab 1 Linear range, related coefficient andcalibration curves

2.2.2 精密度試驗 分別對沒食子酸濃度為49.4 μg/mL、鞣花酸濃度74.0 μg/mL、白皮杉醇濃度60.6 μg/mL、白藜蘆醇濃度45.1 μg/mL的對照品溶液進行11次平行測定，沒食子酸、鞣花酸、白皮杉醇、白藜蘆醇峰面積的RSD分別為1.6%、2.7%、3.0%、2.5%，遷移時間RSD分別為0.8%、0.2%、0.1%、0.5%。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗 精密稱取產(chǎn)地為廣西桂林的桃金娘干果樣品粉末1.0 g，按1.2.3節(jié)方法制備供試品溶液，在室溫下保存，分別在制備后的0、4、8、12、24、48 h 注入UPLC中進行測定，記錄各個時間樣品的峰面積。計算沒食子酸、鞣花酸、白皮杉醇、白藜蘆醇峰面積的相對標準偏差，分別為1.8%、1.6%、2.3%、2.7%，說明樣品在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4 重復(fù)性試驗 準確稱取產(chǎn)地為廣西桂林的桃金娘干果樣品粉末5份，按1.2.3節(jié)方法制備樣品溶液，在1.2.1節(jié)色譜條件下對樣品進行測定，根據(jù)UPLC測定得到的各個物質(zhì)的峰面積，計算RSD，得到樣品中沒食子酸、鞣花酸、白皮杉醇、白藜蘆醇峰面積的RSD分別為2.0%、2.3%、2.7%，3.0%，結(jié)果顯示該方法具有良好的重現(xiàn)性。

2.2.5 檢出限 根據(jù)IUPAC規(guī)定，得到本法測定沒食子酸、鞣花酸、白皮杉醇、白藜蘆醇的檢出限(3σ, n=11)分別為7.55、2.32、63.7、4.59 ng/mL。

2.3.6 回收率試驗 精密稱取廣西桂林的桃金娘果粉末樣品，按1.2.3節(jié)處理方法制備供試品，將一定濃度的沒食子酸、鞣花酸、白皮杉醇、白藜蘆醇標準溶液分別添加至樣品中，混勻后過濾進行UPLC分析，每個濃度的樣品制備3份溶液，根據(jù)UPLC分析得到的結(jié)果計算回收率和RSD值，結(jié)果見表2。4種酚類物質(zhì)的加標回收率在95.1%～102%之間，RSD為1.5%～2.8%，該法具有較好的回收率和重現(xiàn)性。

表2 沒食子酸、鞣花酸、白皮杉醇、白藜蘆醇測定的回收率(n=3)Tab 2 Detection recoveries of GA、EA、PICE and RES (n=3)

2.4 樣品分析 對不同地區(qū)的桃金娘干果樣品進行分析，考察各地4種酚類物質(zhì)的含量差異。精密稱取桃金娘干果粉末1.0 g，每個各稱取3份平行樣，按1.2.3節(jié)制備供試品溶液，各進樣5 μL，對樣品中的沒食子酸、鞣花酸、白皮杉醇、白藜蘆醇的含量進行分析測定，結(jié)果如表3所示，不同地區(qū)的桃金娘果4種酚類物質(zhì)的含量存在一定的差異。

表3 桃金娘果中沒食子酸、鞣花酸、白皮杉醇和白藜蘆醇的含量測定(n=3)Tab 3 Detection results of GA,EA,PICE and RES in Rhodomyrtus tomentosa (Ait.) Hassk. fruit (n=3)

3 討論與結(jié)論

3.1 UPLC檢測條件的優(yōu)化 同一物質(zhì)在不同檢測波長下具有不同的吸收值。利用PDA檢測器對混合對照品溶液進行全波長(190～400 nm)掃描，結(jié)果顯示沒食子酸、白皮杉醇和白藜蘆醇在220 nm附近具有較強的紫外吸收，而在該波長下溶劑峰對目標檢測物沒食子酸的影響較大；此外，鞣花酸在271 nm、白皮杉醇和白藜蘆醇在300 nm波長附近也有較強吸收峰，而采用多波長同時檢測多種物質(zhì)時會降低靈敏度低，因此綜合考慮，選取中間值280 nm為檢測波長。不同色譜柱由于其構(gòu)型及填充材料的不同對物質(zhì)的分離效果也不同。分別采用Waters BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)、Waters BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)、Waters CORTECS?UPLC?T3色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)對對照品以及樣品溶液進行分離測定，發(fā)現(xiàn)樣品經(jīng)Waters CORTECS?UPLC?T3色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)分離得到的色譜圖峰形更好，基線更平穩(wěn)，分析時間更短。此外，流動相也是色譜分析的一個重要影響因素，不同濃度比例的溶劑以及流動相的酸堿度對待測物質(zhì)的分離程度和色譜峰的峰形有著一定影響。分別比較了乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸、乙腈-0.1%甲酸和乙腈-0.2%甲酸等流動相體系進行梯度洗脫的分離檢測效果。結(jié)果顯示，流動相為乙腈-0.2%磷酸時，4種酚類物質(zhì)在色譜柱上的保留效果最佳、靈敏度更高和分離度更好。這是由于沒食子酸、鞣花酸、白皮杉醇以及白藜蘆醇均為弱酸性物質(zhì)，磷酸能更好地增加保留利于分離，因此，本研究選擇的流動相體系為乙腈-0.2%磷酸，整個分析時間不超過10 min，顯著優(yōu)于現(xiàn)有檢測技術(shù)方法[13-14]。

3.2 樣品預(yù)處理的優(yōu)化 由于酚類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)帶有-OH，根據(jù)相似相溶原理酚類物質(zhì)在醇類溶劑中的溶解度較純水好，因此選擇不同濃度的甲醇和乙醇溶劑(甲醇、80%甲醇、60%甲醇、95%乙醇、80%乙醇、60%乙醇)進行提取實驗，結(jié)果顯示，4種酚類物質(zhì)在甲醇中都具有較好的溶解效果，而且提取液中的雜質(zhì)對目標成分的干擾較小，因此綜合考慮選擇甲醇作為提取溶劑。此外，還考察了料液比對提取量的影響，研究結(jié)果表明，當(dāng)料液比大于1∶30時，酚類物質(zhì)的提取率呈現(xiàn)下降趨勢，這可能是由于隨著提取溶劑甲醇量的增加稀釋了提取樣品，或是高濃度甲醇易揮發(fā)間接降低了料液比，因此綜合考慮，選擇1∶30料液比適宜。提取時間對提取率也存在著重要影響，提取時間太短則提取不充分，而提取時間過長又容易產(chǎn)生熱效應(yīng)降低提取率?？疾觳煌曁崛r間對4種酚類物質(zhì)的提取量的影響，當(dāng)提取時間超過40 min時，提取量增加緩慢并有緩慢下降的趨勢，可能是由于提取時間過長溫度過高，降低了酚類物質(zhì)的溶解度，故選擇超聲提取時間為40 min。

相較于現(xiàn)有的沒食子酸、鞣花酸、白皮杉醇以及白藜蘆醇檢測方法UV、HPLC和HPLC-MS法，本文建立的同時測定桃金娘果中4種酚類物質(zhì)含量的UPLC法更為簡便、快速、重現(xiàn)性好，檢出限達到了ng級，可用于桃金娘果中藥材的質(zhì)量控制及含量測定，為制定桃金娘果藥材標準提供參考依據(jù)。