周芷錦，林仙軍，王彬，陳曉林

(浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州311101)

左旋咪唑是一種廣譜驅(qū)蟲(chóng)藥，廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床治療畜禽胃腸道線蟲(chóng)病、肺絲蟲(chóng)病和豬腎蟲(chóng)病當(dāng)中。除作為驅(qū)蟲(chóng)藥之外，鹽酸左旋咪唑還具有免疫調(diào)節(jié)作用，是一種免疫增強(qiáng)劑，能提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力，增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫功能和細(xì)胞免疫功能[1]。研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸左旋咪唑可顯著提高脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)，對(duì)雛雞有顯著的增重效果，在一定程度上提高生長(zhǎng)性能[2]。目前獸醫(yī)使用中常見(jiàn)的劑型包括鹽酸左旋咪唑片、鹽酸左旋咪唑注射液。目前鹽酸左旋咪唑片在《中國(guó)獸藥典(2015年版)》一部[3]，《美國(guó)藥典》(USP40-NF35)[4]中均有收入?！吨袊?guó)獸藥典(2015年版)》一部[3]中，含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)采用氯仿提取，高氯酸滴定的方法。該方法主要存在氯仿毒性較大，且過(guò)程較為繁瑣，容易出現(xiàn)誤差較大等問(wèn)題。《美國(guó)藥典》[4]采用高效液相色譜法，但對(duì)實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備有較高的要求?；谖墨I(xiàn)參考[4-6]，本著優(yōu)化簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)條件和方法的目的，本文探討用高效液相色譜法測(cè)定鹽酸左旋咪唑片中鹽酸左旋咪唑含量的方法研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀，Angilent 1260，配Angilent DAD檢測(cè)器；METTLER TOLEDO XS205電子天平；KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；METTLER TOLEDO 320酸度計(jì)。

1.2試劑 乙腈、甲醇均為色譜純，德國(guó)默克公司；磷酸二氫鉀、磷酸、三乙胺均為分析純；水為超純水。鹽酸左旋咪唑?qū)φ掌穪?lái)源為中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100167-201203，含量99.9%。

1.3 樣品 實(shí)驗(yàn)樣品由杭州新港動(dòng)物藥業(yè)有限公司等四家單位提供，4個(gè)批次25mg規(guī)格的樣品批號(hào)分別為：20190101,180529,190122,20180703；2個(gè)批次50 mg規(guī)格的樣品批號(hào)分別為：170901,190301。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對(duì)照品溶液配制 取鹽酸左旋咪唑?qū)φ掌芳s10 mg，精密稱(chēng)定，置200 mL容量瓶中，加入適量流動(dòng)相溶解，并用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。

2.1.2 供試品溶液配制 取本品20片，精密稱(chēng)定，研細(xì)，精密稱(chēng)取適量(約相當(dāng)于鹽酸左旋咪唑50 mg)，置100 mL容量瓶中，加入流動(dòng)相適量，超聲10 min溶解，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻；過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液5 mL，置50 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容，搖勻。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(Agilent Eclipse XDB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(三乙胺調(diào)節(jié)pH值至7.0)-乙腈(80∶20,v/v)；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；用二極管陣列檢測(cè)器在190～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，記錄214 nm波長(zhǎng)處的色譜圖。鹽酸左旋咪唑?qū)φ掌饭庾V圖(圖1)，鹽酸左旋咪唑?qū)φ掌啡芤荷V圖(圖2)，供試品溶液色譜圖(圖3)。

圖1 鹽酸左旋咪唑?qū)φ掌啡芤汗庾V圖Fig 1 Spectrogram of Levamisole Hydrochloridereference substance

圖2 鹽酸左旋咪唑?qū)φ掌啡芤荷V圖Fig 2 Solution chromatogram of LevamisoleHydrochloride reference substance

圖3 供試品溶液色譜圖Fig 3 Solution chromatogram of the sample

2.3 線性關(guān)系考察 取鹽酸左旋咪唑?qū)φ掌罚芊Q(chēng)定，加流動(dòng)相制成100 μg/mL的溶液，并配制成1、2.5、5、10、25、50、100 μg/mL等一系列濃度的對(duì)照品溶液。分別精密吸取20 μL,注入色譜儀，測(cè)定。以對(duì)照品濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積值(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在1.024～102.398 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為Y=89.715X+14.765,線性相關(guān)系數(shù)為1.0000。

2.4 回收率試驗(yàn) 以批號(hào)190301的樣品作為本底樣品，精密稱(chēng)取9份，每三份為一組，稱(chēng)取量為應(yīng)稱(chēng)取樣品量的一半(約相當(dāng)于鹽酸左旋咪唑25 mg)，置100 mL容量瓶中；另精密稱(chēng)取鹽酸左旋咪唑?qū)φ掌?，高、中、低濃度?duì)照品加入量按照應(yīng)稱(chēng)取量的80 %、100 %、120%的比例加入上述的三組100 mL容量瓶中，并按照2.1.2的方法配制回收率試驗(yàn)用溶液。按照2.2色譜條件，精密量取20 μL，注入色譜儀中，記錄色譜圖。計(jì)算回收率，回收率=(實(shí)測(cè)量/加入量)×100 %，實(shí)測(cè)添加量=測(cè)得總量-本底鹽酸左旋咪唑量?；厥章式Y(jié)果如表1所示，平均回收率為97.4 %、99.7 %、99.3 %，說(shuō)明檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度良好。

表1 回收率結(jié)果表Tab 1 Results of recovery tate

2.5 精密度 取回收率試驗(yàn)的9份樣品測(cè)定，RSD值按照高、中、低濃度三組分別為0.9%，0.8%，0.6%，說(shuō)明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取重復(fù)性試驗(yàn)的供試品溶液，在0，1.5，3，6，12，16 h時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣，測(cè)得器峰面積分別為4483.87744，4474.66260，4492.76318，4482.00439，4516.70264，4501.69922，其檢測(cè)結(jié)果的RSD為0.3%，說(shuō)明在16 h內(nèi)供試品溶液基本穩(wěn)定。

2.7 耐用性試驗(yàn) 采用三臺(tái)不同的液相和三根不同品牌的色譜柱分三組對(duì)批號(hào)為20190101的樣品進(jìn)行含量測(cè)定。A組為Agilent 1260 DAD液相色譜儀，配Agilent C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；B組為Agilent 1260 VWD液相色譜儀，配Waters C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；C組為Waters 2695-2487液相色譜儀，配Agilent C18(4.6 mm×150 mm ，5 μm)液相色譜柱。樣品配制方法如2.1.2，色譜條件見(jiàn)2.2，含量測(cè)定結(jié)果如表2所示，同一樣品三組含量測(cè)定結(jié)果分別為100.5%，101.3%，101.2%，RSD值為0.5%，說(shuō)明該檢測(cè)方法對(duì)液相和色譜柱品牌無(wú)特殊要求，耐用性良好。

2.8 實(shí)際樣品含量測(cè)定 取1.3中的所有樣品，每個(gè)樣品平行3次，依法測(cè)定其含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 不同液相與不同品牌色譜柱的含量測(cè)定比較Tab 2 Comparison of content determination of different HPLC and different brand columns

表3 液相測(cè)定結(jié)果Tab 3 Determination results of HPLC

3 討論與結(jié)論

3.1 與容量分析結(jié)果比較 取6批次樣品，按照《中國(guó)獸藥典(2015年版)》一部中鹽酸左旋咪唑片的含量測(cè)定項(xiàng)下的滴定法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4，并與高效液相色譜法比較，兩者相對(duì)偏差均不超過(guò)1.0%，結(jié)果無(wú)顯著差異。但滴定法存在以下問(wèn)題：一是需使用毒性較大的三氯甲烷進(jìn)行提??；二是步驟過(guò)長(zhǎng)過(guò)多，實(shí)驗(yàn)誤差較大；三是終點(diǎn)藍(lán)色難以判斷，容易過(guò)終點(diǎn)誤讀，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏高。相比較而言，高效液相色譜法更簡(jiǎn)便，也無(wú)需三氯甲烷、醋酐等危險(xiǎn)化學(xué)試劑，更有利于實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也更為準(zhǔn)確可靠。

表4 液相含量測(cè)定與容量分析結(jié)果比較Tab 4 Comparisons between HPLC and volumetric analysis

3.1 提取方式的選擇 在提取溶劑選擇上，分別采用了65%甲醇、甲醇和流動(dòng)相三種溶劑進(jìn)行超聲提取。結(jié)果表明純甲醇提取后樣品峰形較差，65%甲醇和流動(dòng)相提取后的樣品峰形較好，本文采用了流動(dòng)相提取。在是否過(guò)濾的選擇上，過(guò)濾與不過(guò)濾峰面積相對(duì)偏差為0.2%，對(duì)含量測(cè)定影響不大，由于過(guò)濾后溶液更澄清，更有利于第二步配制，本文采用了過(guò)濾的方法。在超聲時(shí)間的選擇上，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中分別采用了超聲5、10、20 min三種方式，峰面積分別為5255.33350,5262.27686,5247.13623,RSD為0.1%，因此選擇超聲時(shí)間為10 min。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 對(duì)鹽酸左旋咪唑溶液在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，掃描結(jié)果表明在212 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，結(jié)合文獻(xiàn)[5]-[6]報(bào)道中基本選擇214 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，基于212和214 nm屬于光譜掃描誤差內(nèi)，因此還是選擇214 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，與文獻(xiàn)保持一致。

3.3 流動(dòng)相的選擇 本文采用了甲醇-0.2%磷酸溶液以及乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液兩種流動(dòng)相配比進(jìn)行試驗(yàn)，供試品溶液采用流動(dòng)相進(jìn)行稀釋配制成50 μg/mL的溶液。結(jié)果表明，甲醇-0.2%磷酸溶液流動(dòng)相下的鹽酸左旋咪唑峰峰形不理想，峰形有較明顯的拖尾現(xiàn)象，且有較明顯的溶劑吸收峰，出峰時(shí)間在8 min左右，理論板數(shù)在8000左右。而乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(三乙胺調(diào)節(jié)pH值至7.0)(20∶80,v/v)的流動(dòng)相下的鹽酸左旋咪唑峰峰形對(duì)稱(chēng)性良好，無(wú)干擾，無(wú)拖尾，出峰時(shí)間在13 min左右更為合理，無(wú)明顯的溶劑吸收峰，理論板數(shù)在10000以上。因此選擇后者作為流動(dòng)相更適宜。

采用高效液相色譜法對(duì)鹽酸左旋咪唑片中鹽酸左旋咪唑的含量進(jìn)行測(cè)定，對(duì)提取溶劑，提取方式和色譜條件進(jìn)行了研究和優(yōu)化，方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明該方法定量準(zhǔn)確，與現(xiàn)行有效標(biāo)準(zhǔn)的含量結(jié)果一致，為鹽酸左旋咪唑片的質(zhì)量控制提供了更快捷、便利的操作方法。