周汝順，江燕，陳啟友，李裕

(湖南省獸藥飼料監(jiān)察所，長(zhǎng)沙 410006)

穿心蓮是爵床科穿心蓮屬植物，又名欖核蓮、一見(jiàn)喜，為一年生草本植物。藥用穿心蓮為植物穿心蓮 [Andrographispaniculata(Burm.f.)Nees]的干燥地上部分，具有清熱解毒，消腫止痛的功效[1]。穿心蓮中的成分復(fù)雜，已從中分離出多種二萜內(nèi)酯類(lèi)、黃酮類(lèi)以及其他成分[2]。其中二萜內(nèi)酯類(lèi)成分是其用于治療急性痢疾、胃腸炎、咽喉炎、扁桃體炎、感冒發(fā)熱等的有效成分，但由于穿心蓮內(nèi)酯等二萜內(nèi)酯類(lèi)成分水溶性較差且遇熱不穩(wěn)定[3-4]，在傳統(tǒng)生產(chǎn)提取過(guò)程中易被破壞，提取率低，因此本文通過(guò)試驗(yàn)旨在探索超聲提取最佳生產(chǎn)工藝，為穿心蓮有效成分的提取提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 Agilent 1200高效液相色譜儀(含四元梯度泵，紫外檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，色譜工作站)，梅特勒MS205DU電子天平，QYTC型臺(tái)式超聲波清洗機(jī)，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純；穿心蓮內(nèi)酯(批號(hào)110797-200307，來(lái)源中國(guó)藥品生物制品檢定所)，脫水穿心蓮內(nèi)酯(批號(hào)110854-201308，含量99.7%，來(lái)源中國(guó)食品藥品鑒定研究院)，新穿心蓮內(nèi)酯(批號(hào)B21392，含量≥98%，來(lái)源上海源葉生物科技有限公司)。穿心蓮藥材及穿心蓮葉和莖均由湖南綠亨世源動(dòng)物藥業(yè)有限公司提供，產(chǎn)于廣西貴港。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) Agilent TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 um)，流動(dòng)相：乙腈-水(38∶62)，流速：1.0 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量：10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)：穿心蓮內(nèi)酯為225 nm，新穿心蓮內(nèi)酯為210 nm，脫水穿心蓮內(nèi)酯為254 nm；理論塔板數(shù)按穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯和新穿心蓮內(nèi)酯峰計(jì)算均應(yīng)不低于2000。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯和新穿心蓮內(nèi)酯適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 mL各含0.1 mg的混合溶液，即得。

1.2.3 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取本品10 g，按不同的提取方法提取后制成100 mL提取液。取5 mL過(guò)中性氧化鋁柱，用50%乙醇定容至100 mL，搖勻，即得。

圖1 對(duì)照品液相色譜圖(1為穿心蓮內(nèi)酯峰，2為新穿心蓮內(nèi)酯峰，3為脫水穿心蓮內(nèi)酯峰)Fig 1 HPLC chromatogram of reference substance(1 is andrographolide peak, 2 is Neoandrographolide peak,3 is dehydroandrographolide peak)

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 分別考察不同提取方法，不同乙醇濃度，不同料液比，不同超聲時(shí)間，不同藥用部位等因素對(duì)穿心蓮二萜內(nèi)酯類(lèi)成分總含量(穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯和新穿心蓮內(nèi)酯的總和)的影響。

1.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素研究的基礎(chǔ)上，以二萜內(nèi)酯類(lèi)成分總含量為測(cè)定指標(biāo)，對(duì)影響提取工藝的主要因素(A乙醇含量、B提取時(shí)間、C料液比)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，優(yōu)化超聲提取穿心蓮中二萜內(nèi)酯類(lèi)成分的最佳工藝條件。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 分析所有的樣品均采用隨機(jī)取樣的方法，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為兩次測(cè)定的平均值，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用EXCEL進(jìn)行作圖。正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS18.0數(shù)據(jù)處理軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取方法的選擇 準(zhǔn)確稱(chēng)取穿心蓮10 g,加60%乙醇100 mL做提取液，分別用浸漬24 h、50℃熱浸6 h、超聲1 h、加熱回流1 h及水煎煮2 h的方法提取，計(jì)算不同提取方法下二萜內(nèi)酯類(lèi)總含量，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同提取方法提取二萜內(nèi)酯類(lèi)總含量的比較Fig 2 Comparison of total diterpene lactonesextracted by different extraction methods

從圖2可知，不同方法提取二萜內(nèi)酯類(lèi)總含量以超聲工藝>浸漬工藝>溫浸工藝>回流工藝。超聲提取的得率略高，但四者的差異不顯著，考慮到超聲提取的快捷性和工藝提取的可操作性，超聲提取最合適。

2.1.2 乙醇濃度的選擇 準(zhǔn)確稱(chēng)取穿心蓮10g,分別用100 mL30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90乙醇、無(wú)水乙醇浸泡1 h后超聲提取1 h，計(jì)算不同乙醇濃度下提取二萜內(nèi)酯類(lèi)總含量，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同乙醇濃度提取二萜內(nèi)酯類(lèi)總含量的比較Fig 3 Comparison of total diterpene lactones extractedwith different ethanol concentrations

從圖3可知，隨著乙醇濃度的增加，二萜內(nèi)酯類(lèi)含量逐漸增大，60%濃度時(shí)達(dá)到最高，而后含量稍有下降，但維持在一個(gè)穩(wěn)定的水平。因此選擇60%乙醇作為提取溶劑。

2.1.3 提取時(shí)間的選擇 準(zhǔn)確稱(chēng)取穿心蓮10 g,分別用100 mL 60%乙醇浸泡1 h后超聲提取30 min，1、1.5、2、3 h，計(jì)算不同超聲時(shí)間下提取二萜類(lèi)總含量，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同超聲時(shí)間提取二萜內(nèi)酯類(lèi)總含量的比較Fig 4 Comparison of total diterpene lactonesextracted at different ultrasonic times

從圖4可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，二萜類(lèi)總含量逐漸增大，在1 h后增長(zhǎng)放緩，考慮到提取工藝的經(jīng)濟(jì)性和高效性，選擇超聲提取時(shí)間1 h。

2.1.4 料液比的選擇 準(zhǔn)確稱(chēng)取穿心蓮10 g,分別用50、100、200、300 mL60%乙醇超聲提取1 h，計(jì)算不同料液比下二萜內(nèi)酯類(lèi)總含量，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 不同料液比提取二萜內(nèi)酯類(lèi)總含量的比較Fig 5 Comparison of total content of diterpene lactonesextracted by different solid-liquid ratios

從圖5可知，隨著料液比的增大，二萜類(lèi)總含量逐漸增大，在1∶10后增長(zhǎng)放緩，考慮到提取工藝的經(jīng)濟(jì)性和高效性，選擇料液比為1∶10。

2.1.5 不同藥用部位對(duì)二萜內(nèi)酯總含量的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取穿心蓮葉、穿心蓮莖、穿心蓮藥材(葉不少于30%)各10 g，加100 mL60%乙醇超聲提取1 h，計(jì)算不同藥材部位下二萜類(lèi)總含量，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 不同藥用部位提取二萜內(nèi)酯類(lèi)總含量的比較Fig 6 Comparison of total content of diterpene lactonesextracted from different medicinal parts

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝參數(shù)

2.2.1 正交試驗(yàn)供試品制備及測(cè)定 根據(jù)單因素試驗(yàn)確定的提取條件，對(duì)影響提取工藝的主要因素(A乙醇含量、B提取時(shí)間、C料液比)按3因素3水平進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn)[11-12](見(jiàn)表1)。

表1 正交試驗(yàn)考察因素與水平Tab 1 Factor and level of orthogonal test

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)正交試驗(yàn)樣品測(cè)得結(jié)果，采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行直觀分析及方差分析，結(jié)果見(jiàn)表2，表3。

表2 L9(3*3)正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 The results of Orthogonal test

表3 方差分析表Tab 3 The table of Variance analysis

從上表可知，影響穿心蓮二萜內(nèi)酯類(lèi)總含量的各因素主次關(guān)系為A>C>B,即乙醇濃度>料液比>超聲時(shí)間。經(jīng)過(guò)方差分析，乙醇濃度對(duì)總含量有顯著影響，超聲時(shí)間和料液比對(duì)總含量的影響不顯著。由此可得最佳提取工藝為A3B2C2，即乙醇濃度60%，超聲時(shí)間1 h，料液比為1∶15下提取率最高。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 按優(yōu)選的最佳提取工藝進(jìn)行試驗(yàn)，即乙醇濃度60%，超聲時(shí)間1 h，料液比1∶15，測(cè)定穿心蓮二萜類(lèi)總含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab 4 The results of validation test

3 討論與結(jié)論

3.1 質(zhì)量控制方法的選擇 穿心蓮含多種二萜內(nèi)酯類(lèi)成分，主要有穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯和去氧穿心蓮內(nèi)酯等4種。穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯是目前穿心蓮藥材及相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制成分[5]，有文獻(xiàn)報(bào)道新穿心蓮內(nèi)酯有較好的藥理活性[6-8]。參照路新華[9]的研究，因此本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯和新穿心蓮內(nèi)酯三種二萜內(nèi)酯類(lèi)成分的總含量來(lái)評(píng)價(jià)和控制穿心蓮藥材的質(zhì)量，保證其療效。本試驗(yàn)通過(guò)切換波長(zhǎng)法同時(shí)測(cè)定上述三種二萜內(nèi)酯類(lèi)成分，穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯和新穿心蓮內(nèi)酯經(jīng)紫外分光光度計(jì)掃描分別在225、254、203 nm處有最大吸收，考慮到203 nm為近紫外區(qū)，干擾較大，基線不穩(wěn)定，因此選取210 nm作為新穿心蓮內(nèi)酯的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 超聲提取方法的選擇 不同方法提取二萜內(nèi)酯類(lèi)總含量以超聲工藝>浸漬工藝>溫浸工藝>回流工藝，這與張建強(qiáng)的研究基本一致[4]。而水煎煮法提取的二萜內(nèi)酯類(lèi)總含量明顯低于醇提法，這主要是因?yàn)榇┬纳徶械某煞菥哂袩岵环€(wěn)定性，上述二萜內(nèi)酯類(lèi)成分水溶性較差且遇熱不穩(wěn)定。根據(jù)聶凌云等[3]的研究表明，短時(shí)間內(nèi)加熱對(duì)內(nèi)酯類(lèi)穩(wěn)定性影響不大，溫度升高至85 ℃, 穿心蓮內(nèi)酯含量隨加熱時(shí)間增加而下降明顯，脫水穿心蓮內(nèi)酯含量會(huì)略有提高，但兩者之和也呈下降趨勢(shì)。長(zhǎng)時(shí)間加熱會(huì)導(dǎo)致內(nèi)酯環(huán)的結(jié)構(gòu)破壞, 從而使兩者含量的總和下降，這說(shuō)明穿心蓮二萜內(nèi)酯類(lèi)成分受熱不穩(wěn)定，不適宜用加熱提取的方法。

根據(jù)不同藥用部位提取的二萜類(lèi)總含量結(jié)果顯示，穿心蓮莖和葉中穿心蓮內(nèi)酯類(lèi)成分含量相差很大，莖中總含量不到葉中三分之一,這與陳敏武的研究一致[10]。穿心蓮藥材根據(jù)葉含量的不同，價(jià)格各不相同，據(jù)調(diào)查，市場(chǎng)上穿心蓮葉和莖大多分開(kāi)銷(xiāo)售，只有極少數(shù)是一起銷(xiāo)售的。所以《中國(guó)獸藥典》中規(guī)定穿心蓮藥材中葉的含量不得低于30%是有必要的。一些以穿心蓮為原料藥的制劑應(yīng)加大葉的投料比例，以提高療效和產(chǎn)品質(zhì)量。

3.3 結(jié)論 本文以乙醇濃度，提取時(shí)間，料液比3個(gè)因素，應(yīng)用超聲波提取法進(jìn)行單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)，得到最佳提取條件：即乙醇濃度為60%，提取時(shí)間1 h，料液比為1∶15。在該條件下穿心蓮二萜內(nèi)酯總含量為2.27，RSD值為1.3%。本研究所優(yōu)化的提取工藝簡(jiǎn)便，穩(wěn)定，可行，提取率高，可為穿心蓮有效成分的提取提供理論依據(jù)。