郭澍強(qiáng)，賀生芳，郝俊虎，談靜慧，楊旭光，李婧

(寧夏檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心，銀川 750002)

沙門氏菌是腸桿菌科中的一個(gè)重要菌屬[1]，可引起雞白痢、禽傷寒、犢牛腹瀉、奶牛乳房炎等多種動(dòng)物疾病[2-4]。同時(shí)，沙門氏菌也是一種重要的食源性致病菌，據(jù)統(tǒng)計(jì),目前世界上85%的食物中毒是由沙門氏菌引起的[5]。目前，對沙門氏菌的傳統(tǒng)檢測方法需要較長的實(shí)驗(yàn)周期，試劑多且雜[6]，在快速、特異檢測方面具有一定的局限性。而其它各種檢測方法敏感、快速，卻需昂貴龐大的儀器設(shè)備、復(fù)雜繁瑣的電泳過程等，進(jìn)而使檢測在受到條件限制的檢驗(yàn)工作中，很難得到普遍應(yīng)用[7]。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是Notomi等人在2000年發(fā)明的一種新的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。LAMP技術(shù)可實(shí)現(xiàn)在恒溫條件下(一般在60～65 ℃)快速連續(xù)擴(kuò)增,具有實(shí)驗(yàn)過程快速、簡便,儀器設(shè)備簡單、便攜,檢測結(jié)果特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。LAMP擴(kuò)增結(jié)果觀察方式多,凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果、肉眼觀察顏色變化及試紙條技術(shù)，也可使用實(shí)時(shí)熒光法和實(shí)時(shí)濁度法,通過實(shí)時(shí)熒光PCR儀或?qū)崟r(shí)濁度儀對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察[8]。針對我國目前嚴(yán)峻的食品安全問題和復(fù)雜的口岸衛(wèi)生監(jiān)控形勢，本文開展了沙門氏菌LAMP快速檢測方法的研究，以實(shí)現(xiàn)對沙門氏菌的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株及抗原 沙門氏菌實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)菌株購自中國工業(yè)微生物保存中心和北京路橋技術(shù)股份有限公司，試驗(yàn)用凝集抗原購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，詳情見表1。

表1 菌種及抗原Tab 1 Strains and antigens

1.1.2 主要試劑和設(shè)備 上海生工細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒(產(chǎn)品批號(hào)：B518225)，榮研生物科技(中國)有限公司2×反應(yīng)緩沖液RM、Bst DNA聚合酶(產(chǎn)品批號(hào)：5Z006)，天根2×Taq PCR Master Mix(產(chǎn)品批號(hào)：P4218)，DL 1000 DNA Marker(產(chǎn)品編號(hào)：3591A)，Applied Biosystems Veriti 96-Well PCR擴(kuò)增儀，日本榮研LT-16alpha 恒溫?cái)U(kuò)增基因檢測系統(tǒng)，Bio-radChemiDocXRS+凝膠成像系統(tǒng)，北京市六一儀器廠DYY-12型電泳儀，Heal Force生物安全柜。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)合成 按照LAMP引物設(shè)計(jì)原則,根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的沙門氏菌特異基因組序列,進(jìn)行多序列比對,尋找一段高度保守區(qū)作為擴(kuò)增對象,然后通過分子生物學(xué)軟件LAMP Designer5設(shè)計(jì)4組引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,采用HPLC純化方式。合成后的引物用超純水稀釋成100 pmol/L溶液,-20 ℃保存?zhèn)溆?。各引物序列見?。

表2 沙門氏菌的LAMP檢測用引物Tab 2 Primers for LAMP Detection of Salmonella

1.2.2 最優(yōu)引物的篩選 將生工生物工程(上海)股份有限公司合成的4組引物(invA引物組、hilA引物組、hut引物組、invE引物組)以沙門氏菌DNA為模板，吸取20 μL反應(yīng)緩沖液和1μL Bst DNA聚合酶制備預(yù)混溶液，每個(gè)反應(yīng)管添加20 μL預(yù)混溶液，再添加5 μL試樣溶液或?qū)φ杖芤?，待上機(jī)，后續(xù)試驗(yàn)溶液配制同等，在榮研LT-16alpha恒溫?cái)U(kuò)增基因檢測系統(tǒng)上同時(shí)進(jìn)行LAMP反應(yīng)，并設(shè)空白對照，反應(yīng)溫度為65 ℃，反應(yīng)時(shí)間為60 min。日本榮研LT-16alpha 恒溫?cái)U(kuò)增基因檢測系統(tǒng)有Left和Right兩個(gè)反應(yīng)槽，各反應(yīng)槽有8個(gè)反應(yīng)孔，其中Left反應(yīng)槽的反應(yīng)孔編號(hào)為NO.1-8，Right反應(yīng)槽的反應(yīng)孔編號(hào)為NO.9-16，反應(yīng)結(jié)束后觀察擴(kuò)增曲線并讀取Tt(濁度上升開始時(shí)間)值和Df(濁度上升值)值。

1.2.3 LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化

1.2.3.1 反應(yīng)溫度的優(yōu)化 以1.2.2篩選的最優(yōu)引物組作為反應(yīng)溫度優(yōu)化的擴(kuò)增引物，以沙門氏菌DNA為模板，95 ℃酶失活2 min,做6組對照,分別將反應(yīng)混合物放在60 ℃、61 ℃、62 ℃、63 ℃、64 ℃、65 ℃反應(yīng)條件下進(jìn)行LAMP反應(yīng)，并設(shè)空白對照，反應(yīng)結(jié)束后觀察擴(kuò)增曲線并讀取Tt值和Df值。

1.2.3.2 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化 以1.2.2篩選的最優(yōu)引物組作為擴(kuò)增引物，以沙門氏菌DNA為模板，以1.2.3.1篩選的最優(yōu)溫度設(shè)為反應(yīng)溫度，95 ℃酶失活2 min,做4組對照,分別將反應(yīng)混合物放在30 min、40 min、50 min、60 min反應(yīng)條件下進(jìn)行LAMP反應(yīng)，并設(shè)空白對照，反應(yīng)結(jié)束后觀察擴(kuò)增曲線并讀取Tt值和Df值。

1.2.4 特異性試驗(yàn) 為了驗(yàn)證設(shè)計(jì)引物對沙門氏菌檢測的特異性,用1.2.2反應(yīng)體系和1.2.3優(yōu)化后條件,以7株非沙門氏菌細(xì)菌和4株陽性對照沙門氏菌培養(yǎng)物提取的DNA、雞白痢及禽傷寒沙門氏菌凝集抗原DNA、布氏桿菌試管凝集抗原DNA、炭疽沉淀抗原DNA為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增檢測，并設(shè)置空白對照，NO.2-8(a)依次為甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、雞白痢及副傷寒沙門氏菌凝集抗原、腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、痢疾志賀菌，NO.10-16(b)依次為阪崎桿菌、霍亂弧菌、腸出血行大腸桿菌O157:H7、致病性大腸埃希氏菌、布氏桿菌試管凝集抗原、單增李斯特菌、炭疽沉淀抗原，Left反應(yīng)槽的NO.1和Right 反應(yīng)槽的NO.9均為空白對照，反應(yīng)結(jié)束后觀察各反應(yīng)孔有無擴(kuò)增曲線的出現(xiàn)。

1.2.5 靈敏度試驗(yàn) 37 ℃培養(yǎng)后的菌液，用生理鹽水10倍倍比稀釋至10-10。取菌落數(shù)在30～300之間的平板作平板計(jì)數(shù)，用該濃度級(jí)的3個(gè)平板菌落均數(shù)推算細(xì)菌濃度：菌落均數(shù)×稀釋倍數(shù)×10；經(jīng)平板計(jì)數(shù)，沙門氏菌原菌液濃度為5×108CFU/mL，10倍倍比稀釋后，對系列稀釋的菌液進(jìn)行LAMP與PCR檢測,LAMP反應(yīng)條件同上，PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性40 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存反應(yīng)產(chǎn)物,反應(yīng)結(jié)束后,取反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測，預(yù)計(jì)PCR產(chǎn)物長度為194 bp，LAMP反應(yīng)結(jié)束后觀察各反應(yīng)孔有無擴(kuò)增曲線的出現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 最優(yōu)引物的篩選 反應(yīng)結(jié)束后，通過觀察擴(kuò)增曲線并讀取Tt值和Df值。結(jié)果顯示，invA引物組和hut引物組有擴(kuò)增曲線，invA引物組Tt值最早，且Df最高(圖1)，說明invA引物組為最優(yōu)引物組。invA引物組Tt值和Df值的具體數(shù)值見表3。

NO.1-5分別為空白對照、invE引物組、hilA引物組、hut引物組和invA引物組NO.1-5 were the blank control group, invE primer group, hilA primer group,hut primer group and invA primer group圖1 篩選最優(yōu)引物組擴(kuò)增曲線圖Fig 1 Screening the amplification curveof the optimal primer group

表3 LAMP引物篩選試驗(yàn)Tt值和Df值
Tab 3 Tt and Df values of LAMP primer screening test

NO擴(kuò)增組Tt值/minDf值1空白對照----2invE引物組----3hilA引物組----4Hut引物組28∶0920255invA引物組25∶542097

2.2 LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.2.1 反應(yīng)溫度的優(yōu)化 反應(yīng)結(jié)束后，通過觀察擴(kuò)增曲線并讀取Tt值和Df值。結(jié)果顯示，當(dāng)反應(yīng)溫度為64 ℃時(shí),引物組Tt值最早，且Df最高，擴(kuò)增效果最好，說明最優(yōu)反應(yīng)溫度為64 ℃。各反應(yīng)組Tt值和曲Df值具體數(shù)值見表4。

表4 LAMP反應(yīng)溫度優(yōu)化試驗(yàn)的Tt值和Df值Tab 4 Tt and Df values of LAMP reaction temperatureoptimization were obtained

2.2.2 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化 反應(yīng)結(jié)束后，通過觀察擴(kuò)增曲線并讀取Tt值和Df值。結(jié)果顯示，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為40 min時(shí),引物組Tt值最早，且Df最高，擴(kuò)增效果最好，用時(shí)最短，因此，引物組invA擴(kuò)增反應(yīng)的最佳時(shí)間為40 min。各反應(yīng)組Tt值和Df值具體數(shù)值見表5。

2.3 特異性試驗(yàn) 從圖2可以看出，a中NO.2-6反應(yīng)孔有擴(kuò)增曲線，其余反應(yīng)孔均無擴(kuò)增曲線，說明只有以沙門氏菌純培養(yǎng)物、雞白痢及副傷寒沙門氏菌凝集抗原提取的DNA模板有擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，其他反應(yīng)孔均無擴(kuò)增曲線出現(xiàn)。因此，引物組invA引物組對沙門氏菌具有特異性，可用于對腸道沙門氏菌6個(gè)亞種的特異性檢測。

表5 LAMP反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化試驗(yàn)的Tt值和Df值Tab 5 Tt and Df values in optimal LAMPreaction time were obtained

NO.2-8(a)依次為甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、雞白痢及副傷寒沙門氏菌凝集抗原、腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、痢疾志賀菌;NO.10-16(b)依次為阪崎桿菌、霍亂弧菌、腸出血行大腸桿菌O157:H7、致病性大腸埃希氏菌、布氏桿菌試管凝集抗原、單增李斯特菌、炭疽沉淀抗原;NO.1和NO.9均為空白對照NO.2-8 (a) were Paratyphoid salmonella a, Paratyphoid salmonella b, Paratyphoid salmonella murine, Pullorum gallinae andParatyphoid salmonella agglutination antigen, Salmonella enteritis, Staphylococcus aureus, Shigella dysentery, respectively; NO.10-16 (b) were successively Enterobacter sakazakii,Vibrio cholerae, E.coli O157:H7, pathogenic E.coli, Brucella in vitroagglutination antigen, Listeria monocytogenes,and Anthrax precipitation antigen,NO.1 and NO.9 were blank controls圖2 特異性實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增曲線圖Fig 2 Amplification curves of specific experiments

2.4 靈敏度試驗(yàn) LAMP檢測擴(kuò)增曲線結(jié)果見表6，LAPM靈敏度試驗(yàn)檢測結(jié)果見圖3，PCR檢測結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，PCR法檢測限為 102CFU/mL，LAMP檢測限為10，其檢測靈敏度是PCR方法的10倍，說明LAMP檢測方法的靈敏度優(yōu)于PCR法。

表6 靈敏度試驗(yàn)的LAMP檢測結(jié)果Tab 6 LAMP test results of sensitivity test

圖3 LAPM靈敏度試驗(yàn)檢測結(jié)果電泳圖Fig 3 Electrophoresis diagram of theresults of LAPM sensitivity test

1-8分別為107～101CFU/mL菌液和空白對照圖4 靈敏度試驗(yàn)PCR檢測電泳圖Fig 4 Electrophoresis was detected by PCR sensitivity test

3 討論與結(jié)論

沙門氏菌病為人獸共患病，沙門氏菌即可引起多種動(dòng)物感染，同時(shí)作為一種重要的食源性致病菌也可引起人類多種疾病。沙門氏菌在人類和動(dòng)物上引起的疾病主要臨床癥狀表現(xiàn)為敗血癥和腸炎引起的腹瀉，其臨床表現(xiàn)與其它細(xì)菌、病毒引起的疾病癥狀非常相似，難以鑒別。隨著人們對食品安全問題的重視程度日漸增高和基層獸醫(yī)、一線口岸對快速檢測、快速通關(guān)的要求，傳統(tǒng)檢測沙門氏菌耗時(shí)長、過程復(fù)雜，難以滿足快速檢測的要求。所以，有必要建立一種能快速、準(zhǔn)確、簡便、費(fèi)用低廉的檢測沙門氏菌的方法。而LAMP技術(shù)在特異性、靈敏度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)設(shè)備等方面占據(jù)明顯優(yōu)勢，已被應(yīng)用于細(xì)菌、病毒等的檢測。LAMP技術(shù)優(yōu)點(diǎn)突出，不需要模板熱變性、長時(shí)間溫度循環(huán)、繁瑣的電泳等過程，效率高，觀察結(jié)果方便多樣，非常適合基層和口岸一線工作人員大規(guī)模樣品的快速檢測。

相關(guān)研究表明，沙門氏菌invA基因具有屬特異性，常被用作檢測沙門氏菌的靶向基因[9]。本實(shí)驗(yàn)通過對沙門氏菌invA特異性基因設(shè)計(jì)內(nèi)外側(cè)4條引物，通過對反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了腸道沙門氏菌6個(gè)亞種的LAMP快速檢測方法，方法靈敏度可達(dá)到101CFU/mL(細(xì)菌濃度),其靈敏度比普通PCR高10倍且反應(yīng)結(jié)果易于觀察。LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析容易發(fā)生氣溶膠污染，添加指示劑增加試驗(yàn)復(fù)雜程度，且觀察容易出現(xiàn)誤判。本試驗(yàn)利用LAMP等溫實(shí)時(shí)濁度儀，通過測定擴(kuò)增基因時(shí)出現(xiàn)的副產(chǎn)物焦磷酸鎂的混濁度來判斷是否存在目標(biāo)基因。本方法通過儀器讀取濁度吸光值，觀察有無擴(kuò)增曲線直接定性判定沙門氏菌檢測陰陽性，方法操作方便快捷，靈敏度高，特異性強(qiáng)，恒溫條件下實(shí)現(xiàn)快速檢測，同時(shí)也避免了氣溶膠對實(shí)驗(yàn)室的污染，特別適用于基層獸醫(yī)、食品及口岸一線部門檢測使用，對動(dòng)物沙門氏菌及食品安全進(jìn)行快速篩查具有重要意義。