胡淋淋，馬聞苛，李曉芳，張紅偉，樊 騰，楊明月，徐璐丹，張文杰，岳修勤

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院麻醉科,河南 衛(wèi)輝 453100)

急性心肌梗死是一種由于冠狀動脈急性閉塞或狹窄導致的急性心血管疾病，患者多表現(xiàn)為長時間的壓榨樣胸骨后疼痛伴窒息感，休息或口服硝酸酯類藥物不能有效緩解，伴有血清心肌酶水平增高及動態(tài)性心電圖變化，可并發(fā)惡性心律失常、心源性休克及心力衰竭，治療不及時常導致患者猝死[1]。急性心肌缺血后如何更好地保護缺血心肌，降低圍術期病死率，是目前臨床研究熱點。胸段硬膜外阻滯是臨床上常用的椎管內(nèi)麻醉方法之一，通過胸段硬膜外阻滯可以阻斷心臟交感神經(jīng)，減少交感神經(jīng)末梢兒茶酚胺類的釋放，使有病變的冠狀動脈血管管徑擴張，增加缺血心肌血液供應，進一步減少心肌缺血梗死引起的心肌細胞凋亡[2]。本實驗通過檢測大鼠心肌組織中凋亡蛋白Caspase-3活性，觀察胸段硬膜外阻滯對急性心肌梗死時心肌細胞凋亡的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選取8～10周齡清潔級健康雄性Wistar 大鼠50只(購于鄭州大學實驗動物中心)，體質(zhì)量(300±20)g，大鼠之間體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；排除急性心肌梗死后或硬膜外給藥后死亡大鼠14例，實際納入36例。

1.2 主要試劑與儀器大鼠心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購自南京森貝加公司，β-actin抗大鼠單克隆一抗、辣根過氧化物酶標記二抗購自美國Jackson Immuno Research公司，放射免疫沉淀測定(radio-Immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液、苯甲基磺酰氯(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)、聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒、聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液2×、上樣緩沖液(6×Loading Buffer)、四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine,TEMED)購自武漢博士德生物工程有限公司，焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)購自北京索萊寶科技有限公司，麗春紅染液購自上海碧云天生物技術研究所，脫脂奶粉購自美國Amresco公司，胎牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)購自韓國Biosharp公司；尼康普通雙目顯微鏡購自上海普赫光電科技有限公司，RGZ-120型體重計購自河南曙光健士醫(yī)療器械集團股份有限公司，多功能生物信息采集系統(tǒng)、小動物呼吸機購自上海奧爾科特生物科技公司，Mini ProTEBn 3 Cell小型垂直電泳儀、半干式轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購自北京君意東方電泳設備有限公司，聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜購自武漢博士德生物工程有限公司，96孔板購自美國Corning Costar公司，掃描儀購自愛普生有限公司，普通高速離心機、-80 ℃超低溫冰箱、全波長掃描酶標儀購自美國Thermo Scientific公司，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱購自德國Heraeus公司。

1.3 實驗分組和各組干預措施將36只大鼠隨機分為假手術組、模型組和羅哌卡因組，每組12只。造模前各組大鼠硬膜外腔置管，羅哌卡因組大鼠經(jīng)硬膜外腔注入5 g·L-1羅哌卡因(0.125 mL·kg-1)進行胸段硬膜外阻滯[3]，假手術組和模型組大鼠硬膜外腔注入等量生理鹽水。羅哌卡因組大鼠給藥5～6 min 后若出現(xiàn)心率減慢，平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)下降，大鼠眼瞼下垂，胸前阻滯區(qū)域體表溫度升高，胸腹部肌肉松弛，即判定為胸段硬膜外阻滯成功。

胸段硬膜外阻滯成功后，羅哌卡因組、模型組大鼠采用結(jié)扎左冠狀動脈前降支的方法[4-6]制備急性心肌梗死模型，假手術組大鼠僅穿線不結(jié)扎左冠狀動脈前降支。結(jié)扎后大鼠左心室前壁顏色變蒼白、心電圖出現(xiàn)ST-T融合抬高，提示造模成功。

1.4 各組大鼠心電圖及血流動力學監(jiān)測在大鼠四肢安裝心電圖導聯(lián)，連接多功能生物信號采集系統(tǒng)，記錄開胸前(T0)、冠狀動脈結(jié)扎前(T1)、冠狀動脈結(jié)扎后3 h(T2)各組大鼠心率(heart rate，HR)、心電圖走勢及MAP。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測各組大鼠血清cTnI水平分別于T0、T1、T2時取大鼠動脈血0.5 mL，室溫靜置20 min，1 000×g離心20 min，取血清,應用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗法測定cTnI水平。

1.6 Western blot法檢測各組大鼠心肌組織中Caspase-3蛋白表達取梗死區(qū)心肌組織，液氮冷凍后-80 ℃保存待測。取100 mg冷凍心肌組織，剪碎后按照1 mg組織加入20 μL裂解液的配比，使用組織研磨器將組織粉碎，冰上裂解40 min，4 ℃下12 000×g離心20 min，取上清液。采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法測定蛋白濃度，加入5×loading buffer把樣品調(diào)成相同濃度，沸水中煮5 min變性。蛋白變性后將其加樣于聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，含50 g·L-1脫脂奶粉的洗滌緩沖液室溫封閉2 h。TBST洗膜2次，每次 10 min，然后加入稀釋后的一抗，4 ℃溫育過夜，洗滌緩沖液搖洗3次，每次10 min，加入稀釋后的二抗，孵育2 h。使用拍照成像系統(tǒng)顯像拍照，用Image-Pro Plμs6.0圖像分析軟件測定蛋白灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin灰度值的比值作為蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠HR和MAP比較結(jié)果見表1。假手術組大鼠T0、T1、T2時HR、MAP兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；模型組和羅哌卡因組大鼠HR、MAP在T2時顯著低于T0、T1時，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；模型組和羅哌卡因組大鼠HR、MAP在T0、T1時比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。3組大鼠T0、T1時HR、MAP比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；T2時，模型組和羅哌卡因組大鼠HR、MAP顯著低于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；羅哌卡因組大鼠HR、MAP顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 3組大鼠HR和MAP比較

組別nHR/(次·min-1)MAP/mmHg假手術組12 T0434.72±4.95106.76±10.57 T1431.64±5.15105.78±11.88 T2438.76±4.8799.85±7.96模型組12 T0432.68±5.05104.58±8.68 T1433.56±5.04106.56±8.55 T2372.11±4.74ab74.36±5.04ac羅哌卡因組12 T0435.87±4.45105.35±11.89 T1430.63±4.85104.47±12.78 T2399.85±5.15abc90.87±6.56abc

注：與同組T0、T1時比較aP<0.05；與假手術組比較bP<0.05；與模型組比較cP<0.05；1 mmHg=0.133 kPa。

2.2 3組大鼠血清cTnI水平比較結(jié)果見表2。假手術組大鼠血清cTnI水平在T0、T1、T2時比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；模型組和羅哌卡因組大鼠血清cTnI水平在T2時顯著高于T0、T1時，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；模型組和羅哌卡因組大鼠血清cTnI水平在T0和T1時比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。T0、T1時，3組大鼠血清cTnI水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；T2時，模型組和羅哌卡因組大鼠血清cTnI水平顯著高于假手術組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；T2時，羅哌卡因組大鼠血清cTnI水平顯著低于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 3組大鼠血清cTnI水平比較

組別ncTnI /(μg·L-1)T0T1T2假手術組1214.85±1.5715.31±2.1415.56±1.76模型組1214.46±1.2814.45±3.2625.76±1.42ab羅哌卡因組1214.67±1.2914.63±3.2420.15±1.39abc

注：與同組T0、T1時比較aP<0.05；與假手術組比較bP<0.05；與模型組比較cP<0.05。

2.3 3組大鼠心肌組織中Caspase-3蛋白相對表達量比較假手術組、模型組和羅哌卡因組大鼠心肌組織中Caspase-3蛋白相對表達量分別為0.62±0.02、0.95±0.06、0.85±0.04，羅哌卡因組、模型組大鼠心肌組織中Caspase-3蛋白表達水平顯著高于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；羅哌卡因組大鼠心肌組織中Caspase-3蛋白表達水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

cTnI僅存在于心房和心室，與骨骼肌無交叉反應，特異性很強[7]。心肌細胞膜完整時cTnI不能滲出，當心肌細胞因缺血、缺氧，細胞膜的完整性受到破壞時，cTnI通過受損的細胞膜滲出進入血管，其在血清中水平可達正常值的20～50倍，明顯高于其他酶類，在血清中持續(xù)時間較肌酸激酶同工酶雜化型更長。cTnI在AMI發(fā)生后2～4 h即升高，14～20 h 時達到高峰值，5～7 d恢復正常，敏感性非常高[8]。本實驗中發(fā)現(xiàn)，結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支3 h后，模型組和羅哌卡因組大鼠血清cTnI水平較假手術組明顯升高，而羅哌卡因組大鼠給予羅哌卡因胸段硬膜外干預后，血清cTnI水平較模型組明顯降低，說明結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支后，大鼠心肌確實存在缺血性損傷，而胸段硬膜外干預對缺血心肌有一定的保護作用。

有研究表明，胸段硬膜外麻醉可降低HR、全身血管阻力和心肌梗死面積，保護心功能，增加心內(nèi)膜和心外膜血流[9]。本研究結(jié)果顯示，硬膜外麻醉后大鼠MAP有輕微下降，HR無明顯變化。胸段硬膜外阻滯阻斷起源于胸上段的心臟傳入神經(jīng)和交感傳出神經(jīng)，阻止心臟應激神經(jīng)反射和抑制去甲腎上腺素誘發(fā)的急性心肌缺血，有助于減少心肌細胞凋亡，心肌細胞凋亡是心肌持續(xù)性缺血導致心肌損傷的一種主要形式。細胞凋亡和壞死可能導致心肌梗死面積擴大。有研究報道，在心外膜主要動脈閉塞后，細胞凋亡可能是早期心肌損傷的主要形式，而壞死可能成為心肌梗死的主要原因[10]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冠狀動脈結(jié)扎3 h后，羅哌卡因組大鼠心肌組織中Caspase-3蛋白的相對表達量較模型組明顯下降，說明硬膜外干預對結(jié)扎冠狀動脈誘發(fā)的心肌缺血性損傷有一定的保護作用。胸段神經(jīng)阻滯可導致心臟的后負荷循環(huán)和外周阻力減少，這可能有助于改善冠狀動脈循環(huán)和心臟功能。然而，在冠狀動脈永久閉塞后，循環(huán)和冠狀動脈灌注壓的改變以及局部麻醉藥的直接作用對缺血心肌的影響較小，而心肌代謝可能在其中發(fā)揮更大的作用。心肌細胞缺血后發(fā)生凋亡的機制可能與代謝、神經(jīng)、內(nèi)分泌有關。冠狀動脈循環(huán)障礙后心肌的無氧代謝可引發(fā)連鎖反應，可能導致交感神經(jīng)系統(tǒng)活性上調(diào)和兒茶酚胺在心肌中的大量釋放。心肌缺血后，血液供應中斷，在細胞內(nèi)腺嘌呤核苷三磷酸分解產(chǎn)生腺苷；厭氧代謝使氫離子聚積，細胞內(nèi)鈣離子超載[11]，其他離子運輸機制也受到影響，代謝性化學物質(zhì)導致心臟神經(jīng)末梢和皮層受到刺激而產(chǎn)生傳入神經(jīng)沖動增加的變化，反射性地引起交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮，兒茶酚胺釋放增加。研究表明，在急性心肌缺血早期心肌組織中兒茶酚胺濃度過高會導致心肌細胞凋亡[12-13]。過度釋放的去甲腎上腺素，通過激活心肌細胞β-腎上腺素能受體，增加細胞內(nèi)環(huán)化腺核苷一磷酸水平，磷酸化的L-型鈣通道和細胞內(nèi)鈣離子濃度增加，增強心肌細胞凋亡[14]。

硬膜外阻滯不僅在缺血性心臟病治療中應用廣泛，在心臟手術、胸科手術等重大手術應激誘發(fā)的心肌損傷保護方面也有獨特的優(yōu)勢。對冠狀動脈硬化性心臟病患者的研究發(fā)現(xiàn)，硬膜外阻滯可擴張粥樣硬化的冠狀動脈血管，提高冠狀動脈搭橋術后患者左心室的收縮功能[15]，降低血清中cTnI水平，降低術后心肌缺血的發(fā)生率，胸段硬膜外麻醉還可激活缺血心肌組織內(nèi)抗凋亡機制，上調(diào)心肌組織內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2的含量和抑制線粒體釋放細胞色素C和細胞凋亡誘導因子[16],減少心肌細胞凋亡。在大鼠和兔缺血再灌注動物模型的實驗中證明，Caspase家族的三肽抑制劑能夠減少心肌梗死面積[17]。改善心肌血供，維持循環(huán)穩(wěn)定，保證足夠數(shù)量的心肌收縮細胞是缺血性心血管疾病治療的最終目標。胸段硬膜外阻滯通過直接擴張狹窄的冠狀動脈來降低血管阻力，減少心肌氧耗。在氧供一定的前提下，降低心肌氧耗是保護心肌的主要措施。

綜上所述，胸段硬膜外阻滯能夠減輕AMI后的心肌細胞凋亡，對缺血或梗死心肌有一定的保護作用;其機制可能與抑制心交感神經(jīng)過度興奮，減少兒茶酚胺類釋放，緩解冠狀動脈痙攣，增加心肌氧供有關。