董濤　吳倩

[摘要] 目的 研究氯化兩面針堿體外對人喉癌細(xì)胞株Hep-2增殖、凋亡、侵襲及遷移的影響。 方法 體外培養(yǎng)Hep-2細(xì)胞，以5、10、20、40、60、80 μmol/L的氯化兩面針堿作用細(xì)胞，MTT法檢測不同時間和不同濃度的氯化兩面針堿對細(xì)胞生長的抑制作用;Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測10、20、40 μmol/L的氯化兩面針堿對細(xì)胞凋亡的影響;Transwell小室法檢測5、10 μmol/L的氯化兩面針堿對細(xì)胞的侵襲和遷移能力的影響。 結(jié)果 在5、10、20、40、60、80 μmol/L濃度范圍內(nèi)，氯化兩面針堿對Hep-2細(xì)胞的生長抑制率隨著時間的延長逐漸升高，明顯高于對照組同一時間點細(xì)胞（P < 0.05）;在10、20、40 μmol/L范圍內(nèi)，氯化兩面針堿誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡率逐漸增多，與細(xì)胞對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）;與10 μmol/L氯化兩面針堿組比較，20、40 μmol/L氯化兩面針堿組Hep-2細(xì)胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。與細(xì)胞對照組比較，5、10 μmol/L的氯化兩面針堿可顯著降低Hep-2細(xì)胞侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)（P < 0.05）;與5 μmol/L氯化兩面針堿組比較，10 μmol/L氯化兩面針堿組降低得更多（P < 0.05）。 結(jié)論 氯化兩面針堿可抑制人喉癌細(xì)胞株Hep-2細(xì)胞的生長，該抑制作用與誘導(dǎo)其凋亡及降低其侵襲和遷移能力有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 氯化兩面針堿;Hep-2;增殖;凋亡;侵襲;遷移

[中圖分類號] R739.65? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）06（a）-0017-05

Effect of nitidine chloride on cell proliferation， apoptosis， invasion and migration in laryngeal carcinoma cell line Hep-2 in vitro

DONG Tao1? ?WU Qian2

1.Department of Pharmacy， Beijing Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Beijing? ?100039， China; 2.Department of Pharmacy， Affiliated Hospital of Hubei University of Arts and Science? Xiangyang Central Hospital， Hubei Province， Xiangyang? ?441021， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of nitidine chloride on cell proliferation， apoptosis， invasion and migration in laryngeal carcinoma cell Hep-2 in vitro. Methods Hep-2 cells were cultured by nitidine chloride with 5， 10， 20， 40， 60， 80 μmol/L in vitro， and MTT was performed to observe the proliferation at different times. Annexin V-FITC/PI flow cytometry was used to determine the apoptosis rate by nitidine chloride with 10， 20， 40 μmol/L. Transwell method was used to detect the invasion and migration by nitidine chloride with 5， 10 μmol/L. Results At concent of 5， 10， 20， 40， 60， 80 μmol/L， the growth inhibition rate of nitidine chloride on Hep-2 cells increased gradually with the increase of time， compared with the control group at the same time point （P < 0.05）. At concent of 10， 20， 40 μmol/L， the apoptosis rate of Hep-2 cells induced by nitidine chloride gradually increased， compared with the control group， the differences were statistically significant （P < 0.05）; compared with the nitidine chloride with 10 μmol/L， the nitidine chloride with 20， 40 μmol/L increased the apoptosis rate， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Compared to the control group， nitidine chloride with 5， 10 μmol/L reduced the number of cells of invasion and migration of Hep-2 cells significantly （P < 0.05）; compared with the nitidine chloride with 5 μmol/L， nitidine chloride with 10 μmol/L decreased the number more significantly （P < 0.05）. Conclusion Nitidine chloride could inhibit the proliferation of Hep-2 cells， the mechanism is related to the induction of apoptosis and the inhibition of invasion and migration.

2.3 對Hep-2細(xì)胞體外侵襲能力的影響

5、10 μmol/L氯化兩面針堿組Hep-2細(xì)胞侵襲數(shù)與細(xì)胞對照組比較均顯著降低（P < 0.01），提示這兩個濃度的氯化兩面針堿體外可抑制Hep-2細(xì)胞的侵襲能力，該抑制能力隨濃度增加而增強，與5 μmol/L氯化兩面針堿組比較，10 μmol/L氯化兩面針堿組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少（P < 0.05）。見表2。

2.4 對Hep-2細(xì)胞體外遷移能力的影響

5、10 μmol/L的氯化兩面針堿組遷移細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞對照組比較均顯著降低（P < 0.01），濃度越大遷移細(xì)胞數(shù)越少，提示氯化兩面針堿能濃度依賴性地抑制Hep-2細(xì)胞的體外遷移，與5 μmol/L氯化兩面針堿組比較，10 μmol/L氯化兩面針堿組遷移細(xì)胞數(shù)顯著減少（P < 0.01）。見表3。

3 討論

喉癌是發(fā)生于上呼吸道的頭頸部惡性腫瘤，93%～99%的病理分型為喉鱗狀細(xì)胞癌，發(fā)生率占世界范圍內(nèi)每年新發(fā)惡性腫瘤病例的2.4%[6]。常規(guī)治療喉癌的方法預(yù)后并不理想，局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是頭頸部腫瘤影響療效和生存率的重要原因[7]。所以，既能有效抑制腫瘤生長，又可降低其轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)能力的新的治療方法是眾多學(xué)者極力尋找的。而氯化兩面針堿由于具有良好的抗癌作用，已逐漸成為抗癌藥物中的熱門研究對象。

細(xì)胞凋亡是機體自發(fā)啟動的維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一種重要調(diào)節(jié)機制，當(dāng)?shù)蛲鍪タ刂凭蜁鸺?xì)胞無限增殖[8]。腫瘤也稱作細(xì)胞增殖周期紊亂性疾病，其區(qū)別于其他疾病最明顯的特征就是細(xì)胞不受機體正常調(diào)節(jié)而無限制地生長和繁殖。研究表明很多中藥可通過各種機制誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡從而減少其增殖[9-13]，其已成為抗腫瘤的最佳治療方式。已有研究表明，氯化兩面針堿在體外可通過阻斷AKT通路誘導(dǎo)前列腺癌PC-3細(xì)胞凋亡[14]。惡性腫瘤不同于其他疾病的另外一個特征就是能通過淋巴系統(tǒng)或內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)侵襲和遷移至其他組織[15]，并在其他組織中繼續(xù)不斷生長，即為腫瘤轉(zhuǎn)移，這種轉(zhuǎn)移性是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和治療失敗非常重要的原因[16-17]。

喉癌與細(xì)胞凋亡、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移等細(xì)胞生物學(xué)行為密切相關(guān)，侵襲和遷移是喉癌易侵犯周圍組織的主要原因[18-20]，已有的手術(shù)、靶向治療和放療等多種方案對于部分喉癌早期的治療可獲得較好的效果，但是晚期患者的臨床療效欠佳，并常因喉癌的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移影響治療或?qū)е滤劳鯷21-22]。如能有效抑制喉癌生長，并抑制其向周圍轉(zhuǎn)移，可極大地提升喉癌的治愈率。

中醫(yī)藥博大精深，用中藥制劑輔助治療癌癥已成為趨勢[23-25]，氯化兩面針堿是一個非常有前景、可防治腫瘤的中藥，其抗腫瘤的作用較廣泛，體外研究證實其能有效抑制胃癌、鼻咽癌等多種腫瘤的生長[26-27]。本研究將氯化兩面針堿作用于人喉癌Hep-2細(xì)胞，分別采用MTT法、Transwell法、Annexin V-FITC/PI雙染法探討氯化兩面針堿對Hep-2細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的抑制及誘導(dǎo)凋亡的潛在作用機制。研究結(jié)果顯示，氯化兩面針堿能顯著抑制人喉癌Hep-2細(xì)胞的生長，并且在5～80 μmol/L的濃度和24～72 h的時間范圍內(nèi)，隨著濃度和時間的增加抑制率也逐漸增加。Annexin V-FITC/PI檢測發(fā)現(xiàn)，氯化兩面針堿誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞的凋亡率隨著濃度的增加而升高。Transwell實驗表明，氯化兩面針堿濃度越高，Hep-2細(xì)胞侵襲和遷移的細(xì)胞數(shù)也越少，提示其可濃度依賴性地降低Hep-2細(xì)胞的侵襲和遷移能力。這與氯化兩面針堿可以劑量依賴性地抑制SGC-7901細(xì)胞的侵襲和遷移能力結(jié)果是一致的[28]。

綜上，氯化兩面針堿可通過誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡來抑制其生長，并能減少Hep-2細(xì)胞的侵襲和遷移的數(shù)量而抑制其轉(zhuǎn)移，這為臨床治療喉癌提供了一定的研究基礎(chǔ)，但是氯化兩面針堿抑制Hep-2細(xì)胞侵襲和遷移的能力是否與時間有關(guān)，以及通過何種機制抑制其遷移，尚需進一步實驗證實。

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