劉佳　郝秋彥　王竑昕　曹相勛　張海寧

[摘要]目的探討人神經(jīng)導(dǎo)向因子2（Slit2）RNA干擾質(zhì)粒（shRNA`-Slit2）對(duì)骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響及其機(jī)制。方法構(gòu)建shRNA`-Slit2慢病毒載體，將骨肉瘤MG63細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、空白載體病毒組、shRNA`-Slit2載體病毒組?？瞻讓?duì)照組骨肉瘤MG63細(xì)胞不轉(zhuǎn)染慢病毒，空白載體病毒組細(xì)胞轉(zhuǎn)染含空白質(zhì)粒載體的慢病毒，shRNA`-Slit2載體病毒組細(xì)胞轉(zhuǎn)染含shRNA`-Slit2質(zhì)粒載體的慢病毒。分別應(yīng)用RT`-qPCR、Western`-Blot方法檢測(cè)各組Slit2、Robo4以及凋亡因子Caspase`-3和Caspase`-9 mRNA和蛋白的表達(dá)，CCK`-8試劑盒檢測(cè)骨肉瘤MG63細(xì)胞的增殖，Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移，AV`-PI凋亡試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果慢病毒轉(zhuǎn)染效率較高，以骨肉瘤MG63細(xì)胞為靶點(diǎn)種子細(xì)胞，慢病毒轉(zhuǎn)染率為90%。shRNA`-Slit2載體病毒組Slit2、Robo4 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于空白載體病毒組，凋亡因子Caspase`-3和Caspase`-9的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于空白載體病毒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.349～19.989，P<0.05）。CCK`-8檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、空白載體病毒組、shRNA`-Slit2載體病毒組細(xì)胞增殖率比較差異有顯著性（F=23.983，P<0.05）。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、空白載體病毒組、shRNA`-Slit2載體病毒組遷移細(xì)胞數(shù)比較差異有顯著性（F=31.982，P<0.05）。AV`-PI檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、空白載體病毒組、shRNA`-Slit2載體病毒組細(xì)胞凋亡率比較差異有顯著性（F=30.009，P<0.05）。結(jié)論shRNA`-Slit2可以通過(guò)Robo信號(hào)通路抑制骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖及遷移，促進(jìn)其凋亡。

[關(guān)鍵詞]人神經(jīng)導(dǎo)向因子2;骨肉瘤細(xì)胞;增殖;遷移;細(xì)胞凋亡

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of RNA interference plasmid of Slit2 （shRNA`-Slit2） on the proliferation， migration， and apoptosis of osteosarcoma MG63 cells and its mechanism. MethodsThe lentiviral vector of shRNA`-Slit2 was constructed and osteosarcoma MG63 cells were divided into blank control group， empty virus vector group， and shRNA`-Slit2 virus group. The cells in the blank control group were not transfected with the lentivirus， those in the empty virus vector group were transfected with the lentivirus containing empty plasmid vector， and those in the shRNA`-Slit2 virus group were transfected with the lentivirus containing shRNA`-Slit2 plasmid vector. RT`-qPCR and Western`-Blot were used to measure the mRNA and protein expression of Slit2， Robo4， and apoptotic factors caspase`-3 and caspase`-9; CCK`-8 kit was used to evaluate the proliferation of osteosarcoma MG63 cells， Transwell chamber was used to evaluate cell migration， and AV`-PI kit was used to measure cell apoptosis. ResultsThere was high lentiviral transfection efficiency， and with osteosarcoma MG63 cells as the target seed cells， the lentivirus transfection rate was 90%. Compared with the empty virus vector group， the shRNA`-Slit2 virus group had significantly lower relative mRNA and protein expression of Slit2 and Robo4 and significantly higher mRNA and protein expression of apoptotic factors caspase`-3 and caspase`-9 （F=8.349-19.989，P<0.05）. The CCK`-8 assay showed that there was a significant difference in cell proliferation rate between the blank control group， the empty virus vector group， and the shRNA`-Slit2 virus group （F=23.983，P<0.05）. The Transwell assay showed that there was a significant difference in the number of migrating cells between the blank control group， the empty virus vector group， and the shRNA`-Slit2 virus group （F=31.982，P<0.05）. The AV`-PI assay showed that there was a significant difference in cell apoptosis rate between the blank control group， the empty virus vector group， and the shRNA`-Slit2 virus group （F=30.009，P<0.05）. ConclusionShRNA`-Slit2 can inhibit the proliferation and migration and promote the apoptosis of osteosarcoma MG63 cells via the Robo signaling pathway.

[KEY WORDS]Slit2; osteosarcoma cells; proliferation; migration; apoptosis

骨肉瘤多見(jiàn)于年輕人，尤其是20歲以下的青少年和兒童。其惡性程度較高，預(yù)后較差[1`-2]。目前，臨床上針對(duì)骨肉瘤的治療大多是根治性手術(shù)切除加術(shù)后輔助化療，給病人及家庭造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神負(fù)擔(dān)[3`-5]。因此，研究骨肉瘤細(xì)胞增殖和遷移的發(fā)生機(jī)制，尋求新的治療靶點(diǎn)意義重大。Slit是神經(jīng)導(dǎo)向因子家族的一員，它通過(guò)與其受體Robo結(jié)合，構(gòu)成Slit`-Robo信號(hào)通路，在細(xì)胞遷移、炎性反應(yīng)、腫瘤發(fā)生及器官發(fā)育等過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[6`-9]。針對(duì)人神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)導(dǎo)向因子2（Slit2）基因在骨肉瘤中作用的研究較少。本研究采用慢病毒干擾RNA（shRNA）技術(shù)沉默Slit2基因，探討Slit基因以及Robo信號(hào)通路在細(xì)胞中的作用機(jī)制，以期為骨肉瘤的治療提供新的靶點(diǎn)。

1材料與方法

1.1骨肉瘤MG63細(xì)胞的培養(yǎng)

本文實(shí)驗(yàn)以骨肉瘤MG63細(xì)胞為種子靶細(xì)胞，以2×104/cm2的密度將其種植于25 cm×25 cm的培養(yǎng)瓶中，加入含體積分?jǐn)?shù)0.01胎牛血清的RPMI`-1640培養(yǎng)液（Gibco`-BRL， Gaithersburg， MD），之后將細(xì)胞在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、100%濕度條件下孵育。當(dāng)細(xì)胞融合率為70%～80%時(shí)，以2.5 g/L胰蛋白酶消化處理后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取第2代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2shRNA`-Slit2慢病毒載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染以及細(xì)胞分組

載體質(zhì)粒環(huán)狀RNA（LV3）中的loop結(jié)構(gòu)選用了TTCAAGAGA以避免形成終止信號(hào)。正義鏈模板的5′端添加了GATCC，與BamHⅠ酶切后形成的粘端互補(bǔ);反義鏈模板的5′端添加了AATTC，與EcoRⅠ酶切后形成的粘端互補(bǔ)。正義連：5′`-GATCC`-（GN18）`-（TTCAAGAGA）`-（N18C）`-TT`-TTTTG`-3′;反義鏈：3′`-G（CN18）`-（AAGTTCTC`-T）`-（N18G）`-AAAAAACTTAA`-5′。將DNA oligo分別采用TE（pH值8.0）溶解，濃度為100 μmol/L。取相應(yīng)的正、反義鏈oligo溶液，在PCR儀上按照如下程序進(jìn)行退火處理：95 ℃、5 min;85 ℃、5 min;75 ℃、5 min;70 ℃、5 min;4 ℃保存。得到濃度為10 μmol/L的shRNA模板。將所得模板溶液稀釋50倍，終濃度為200 μmol/L，用于連接反應(yīng)。根據(jù)上述慢病毒轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建原則，構(gòu)建目的基因的shRNA`-Slit2慢病毒（包含插入位點(diǎn)）的ZsGreen熒光蛋白標(biāo)記基因序列?？寺〉墓押塑账峥梢栽陔x體shRNA中產(chǎn)生pGLV3/H1/ZsGreen+Puro載體（8 kb）。設(shè)計(jì)的shRNA`-Slit2的引物序列見(jiàn)表1。通過(guò)限制映射和DNA測(cè)序確定shRNA的成功構(gòu)建。慢病毒載體經(jīng)過(guò)36 h的轉(zhuǎn)導(dǎo)后收集并進(jìn)行離心，清除細(xì)胞碎片。慢病毒的效價(jià)為5.0×1010 TU/L。

將骨肉瘤MG63細(xì)胞隨機(jī)分成3組：空白對(duì)照組（不轉(zhuǎn)染慢病毒，A組）、空白載體病毒組（轉(zhuǎn)染含空白質(zhì)粒載體的慢病毒，B組）、shRNA`-Slit2載體病毒組（轉(zhuǎn)染含shRNA`-Slit2質(zhì)粒載體的慢病毒，C組）。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT`-qPCR）檢測(cè)Slit2、Robo4、Caspase`-3和Caspase`-9的mRNA相對(duì)表達(dá)水平

將3組骨肉瘤MG63細(xì)胞經(jīng)2.5 g/L的胰蛋白酶處理，收集入15 mL離心管， 5 000 r/min離心。取細(xì)胞沉淀，加入1 mL的Trizol試劑 （TaKaRa， Japan）裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用PCR酶標(biāo)儀檢測(cè)其純度，保證提取RNA純度為1.9～2.0，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa， Japan）說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃下保存。根據(jù)SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒（Perfect Real`-Time， TaKaRa， Japan）說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行加樣處理，行RT`-qPCR檢測(cè)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將反應(yīng)體系條件設(shè)置為：95 ℃、30 s;1個(gè)循環(huán)。PCR：95 ℃、5 s;60 ℃、30 s， 40個(gè)循環(huán)。溶解曲線：95 ℃、5 s; 60 ℃、1 min。 降溫： 50 ℃、 30 s， 1個(gè)循環(huán)。 然后應(yīng)用FTC`-2000 RT`-qPCR系統(tǒng)分析Slit2、Robo4、Caspase`-3和Caspase`-9的基因表達(dá)量。 內(nèi)參基因GAPDH和Slit 2、Robo4、Caspase`-3、Caspase`-9的引物序列均由上海生工公司設(shè)計(jì)。見(jiàn)表1。采用2-△△Ct方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4Western`-blot檢測(cè)Slit2、Robo4、Caspase`-3和Caspase`-9的蛋白表達(dá)量

各組骨肉瘤MG63細(xì)胞融合率為80%以上時(shí)，PBS沖洗3次，加入RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制劑混合液（100∶1），于冰上裂解1 h，細(xì)胞刮刮取細(xì)胞，超聲裂解，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液加入上樣緩沖液于95 ℃水浴10 min，-80 ℃保存。BCA比色法測(cè)定蛋白濃度，定量上樣進(jìn)行80 g/L的十二烷基硫酸鈉`-聚丙烯酸胺凝膠（SDS`-PAGE）電泳2.0 h。轉(zhuǎn)膜后加一抗稀釋液（抗體稀釋配比為1∶1 000;Santa Cruz Biotechnology， 美國(guó)） 4 ℃孵育過(guò)夜，24 h后用PBS洗膜10 min共3次，后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（抗體稀釋配比為1∶2 000，碧云天，中國(guó)） 37 ℃孵育1 h，洗膜，化學(xué)發(fā)光試劑顯色1 min，置暗盒內(nèi)，X線顯影、定影后曝光。以β`-actin作為內(nèi)參照。應(yīng)用Quantity one 4.6軟件測(cè)量各條帶的吸光度（A）值，以其表示蛋白含量。

1.5Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移

將3組細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后收集，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)方法，將基底膜的基質(zhì)原液放在冷藏冰箱（4 ℃）過(guò)夜融化，然后與預(yù)冷的無(wú)血清的RPMI`-1640按照1∶3的比例配制侵襲上室凝膠液體，以每孔55 μL的量包被Transwell小室的上室，放置在37 ℃的孵育箱，2 h后使上室成膠。然后，在上室每孔接種200 μL不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，下室加入含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的RPMI`-1640培養(yǎng)液500 μL。將Transwell板放置在37 ℃的孵育箱中培養(yǎng)24 h后用結(jié)晶紫染色，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.6CCK`-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖

收集3組經(jīng)胰蛋白酶消化后細(xì)胞，按照CCK`-8試劑盒說(shuō)明書(shū)方法，以每孔50個(gè)的量接種在96孔板中，72 h后每孔加入10 μL的CCK`-8試劑，放到37 ℃孵育箱中培養(yǎng)2 h。然后，應(yīng)用酶標(biāo)儀分別檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處吸光度值，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.7細(xì)胞凋亡檢測(cè)

收集3組經(jīng)胰蛋白酶消化后細(xì)胞，按照AV`-PI試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)3組細(xì)胞的凋亡率。流式細(xì)胞儀分析各組樣本，計(jì)算3組細(xì)胞的凋亡率。Annexin V+/PI-為早期凋亡細(xì)胞，Annexin V+/PI+為晚期凋亡和壞死細(xì)胞，Annexin V-/PI+為正常細(xì)胞。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料結(jié)果用±s形式表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有顯著性。

2結(jié)果

2.1shRNA`-Slit2載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染

以綠色熒光蛋白（GFP）為熒光探針，完成Slit2的RNA干擾慢病毒載體構(gòu)建。shRNA`-Slit2載體慢病毒轉(zhuǎn)染滴度為3×1011TU/L，慢病毒轉(zhuǎn)染效率為（91.07±4.33）%。

2.2各組Slit2、Robo4和凋亡基因Caspase`-3、Caspase`-9的mRNA和蛋白表達(dá)比較

各組Slit2、Robo4 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異有顯著性（F=9.007～19.989，P<0.05），其中shRNA`-Slit2載體病毒組低于空白載體病毒組（q=1.022～5.392，P<0.05）。3組Caspase`-3、Caspase`-9 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異有顯著性（F=8.349～9.078，P<0.05），其中shRNA`-Slit2載體病毒組高于空白載體病毒組（q=1.997～3.142，P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.3各組細(xì)胞遷移數(shù)比較

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、空白載體病毒組和shRNA`-Slit2載體病毒組遷移細(xì)胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=31.982，P<0.05）;其中shRNA`-Slit2載體病毒組低于空白載體病毒組（q=2.983，P<0.05）。見(jiàn)表3。

2.4各組細(xì)胞增殖率比較

CCK`-8檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、空白載體病毒組和shRNA`-Slit2載體病毒組細(xì)胞增殖率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=23.983，P<0.05），其中shRNA`-Slit2載體病毒組低于空白載體病毒組（q=3.982，P<0.05）。見(jiàn)表3。

2.5各組細(xì)胞凋亡率比較

AV`-PI檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、空白載體病毒組和shRNA`-Slit2載體病毒組細(xì)胞凋亡率相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=30.009，P<0.05），其中shRNA`-Slit2載體病毒組高于空白載體病毒組（q=8.311，P<0.05）。見(jiàn)表3。

3討論

骨肉瘤是骨腫瘤科常見(jiàn)的惡性腫瘤，其惡性度比較高，有關(guān)研究顯示根治術(shù)輔助化療后其5年生存率并沒(méi)有明顯的提高[10`-13]。骨肉瘤細(xì)胞的惡性增殖以及癌細(xì)胞遷移是造成腫瘤病情進(jìn)展的關(guān)鍵原因之一[14`-16]，故了解骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移以及凋亡機(jī)制具有重要的臨床意義。本文研究探討shRNA`-Slit2基因?qū)侨饬鯩G63細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響及其機(jī)制，以期為臨床骨肉瘤的治療提供新的治療靶點(diǎn)。結(jié)果顯示，shRNA`-Slit2可以通過(guò)Robo信號(hào)通路抑制骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖及遷移，促進(jìn)其凋亡，提示Slit2可以作為骨肉瘤治療的潛在靶點(diǎn)，為臨床上骨肉瘤的治療提供一個(gè)新的思路。

Slit是神經(jīng)導(dǎo)向因子家族的一員，它通過(guò)與其受體Robo結(jié)合，構(gòu)成Slit`-Robo信號(hào)通路，在細(xì)胞遷移、炎性反應(yīng)、腫瘤發(fā)生及器官發(fā)育等過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[17`-19]。既往研究顯示，Slit2/Robo4信號(hào)通路在炎性遞質(zhì)表達(dá)和平滑肌細(xì)胞增殖中有促進(jìn)作用[20`-21]。提示Slit2/Robo4信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡。然而，Slit2/Robo4信號(hào)通路在骨肉瘤MG63細(xì)胞中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本文研究以慢病毒作為轉(zhuǎn)染媒介，介導(dǎo)siRNA干擾質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞，探討Slit2/Robo4信號(hào)通路在骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和細(xì)胞凋亡中的作用及其機(jī)制。結(jié)果顯示，慢病毒轉(zhuǎn)染效率均高于90%，說(shuō)明慢病毒轉(zhuǎn)染具有很好的轉(zhuǎn)染性。RT`-qPCR和Western`-Blot結(jié)果顯示，shRNA`-Slit2載體病毒組Slit2、Robo4的mRNA和蛋白表達(dá)水平低于空白載體病毒組，差異有顯著意義;而凋亡相關(guān)因子Caspase`-3、Caspase`-9的表達(dá)明顯高于空白載體病毒組，從基因?qū)用婧偷鞍讓用孀C明將Slit2基因沉默后，Robo`-4明顯降低，shRNA`-Slit2可以促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡，其作用是通過(guò)Robo4信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。目前對(duì)于腫瘤細(xì)胞的行為學(xué)特征研究，主要集中于腫瘤細(xì)胞的遷移、增殖和凋亡[22`-24]。當(dāng)然也有的研究聚焦于腫瘤細(xì)胞的自噬[25`-26]。而尋求關(guān)鍵分子對(duì)于腫瘤的行為學(xué)影響特點(diǎn)，是分子生物學(xué)普遍應(yīng)用的辦法[27`-28]。如鄭穎等[29]探討鴉膽子素對(duì)骨肉瘤的影響，結(jié)果顯示鴉膽子素可以抑制骨肉瘤的增殖，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡，提示鴉膽子素可以作為一種新的骨肉瘤治療藥物。本文的研究結(jié)果則顯示，shRNA`-Slit2載體病毒組骨肉瘤細(xì)胞的遷移數(shù)明顯低于空白載體病毒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明shRNA`-Slit2可以明顯抑制骨肉瘤MG63細(xì)胞的遷移。本文增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，shRNA`-Slit2載體病毒組骨肉瘤細(xì)胞的增殖率明顯低于空白載體病毒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明shRNA`-Slit2可以明顯抑制骨肉瘤MG63細(xì)胞的增殖。AV`-PI凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，shRNA`-Slit2載體病毒組骨肉瘤細(xì)胞的凋亡率明顯高于空白載體病毒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明shRNA`-Slit2可以明顯促進(jìn)骨肉瘤MG63細(xì)胞的凋亡。另外，本研究還分別檢測(cè)了凋亡基因Caspase`-3和Caspase`-9 mRNA和蛋白表達(dá)，研究結(jié)果顯示，將Slit2基因沉默表達(dá)后，Caspase`-3和Caspase`-9的表達(dá)明顯增高。以上結(jié)果表明，Slit2基因在骨肉瘤MG63細(xì)胞的遷移、增殖以及凋亡中起重要的作用，可能成為骨肉瘤的潛在治療靶點(diǎn)。

綜上所述，shRNA`-Slit2可以通過(guò)Robo信號(hào)通路抑制骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖及遷移，促進(jìn)其凋亡。為臨床上骨肉瘤的治療提供新的靶點(diǎn)，為骨肉瘤的治療提供新的思路與方法。

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