譚俊杰 吳文雪 廖艷花 蘇彥兆 李振中 黃健 黃忠仕

摘 要 目的：觀察二苯乙烯苷（TSG）對岡田酸（OA）誘導(dǎo)致NG108-15細(xì)胞Tau蛋白磷酸化的影響，探討該化合物抗阿爾茨海默?。ˋD）的可能機(jī)制。方法：以O(shè)A誘導(dǎo)NG108-15細(xì)胞復(fù)制AD細(xì)胞模型，采用MTT法檢測經(jīng)TSG低、中、高劑量（50、100、200 μmol/L）預(yù)處理后的細(xì)胞存活率，采用吖啶橙/溴乙錠雙染色法檢測細(xì)胞凋亡情況，采用Western blotting法和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法檢測細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶5（CDK5）、糖原合成酶激酶3β（GSK3β）蛋白及其mRNA以及Tau、磷酸化Tau（p-Tau）蛋白的表達(dá)情況，采用免疫熒光法檢測CDK5、GSK3β、Tau蛋白的分布情況。結(jié)果：正常對照組細(xì)胞形態(tài)正常，未見或少見CDK5、GSK3β、Tau蛋白分布。模型組可見固縮或圓珠狀的早期凋亡細(xì)胞，且CDK5、GSK3β、Tau蛋白分布明顯增多，其細(xì)胞存活率顯著降低，CDK5、GSK3β蛋白及其mRNA的相對表達(dá)量以及p-Tau與Tau相對表達(dá)量的比值（p-Tau/Tau）均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。經(jīng)TSG預(yù)處理后，各給藥組早期凋亡細(xì)胞和CDK5、GSK3β、Tau蛋白分布均有所減少，其細(xì)胞存活率均顯著升高，中、高劑量組細(xì)胞CDK5蛋白、p-Tau/Tau以及各劑量組細(xì)胞CDK5 mRNA、GSK3β蛋白及其mRNA的相對表達(dá)量均顯著降低（P<0.05）。結(jié)論：TSG對AD模型細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，這種作用與其提高細(xì)胞存活率，下調(diào)磷酸激酶CDK5、GSK3β的蛋白表達(dá)和基因轉(zhuǎn)錄水平，抑制Tau蛋白的磷酸化有關(guān)。

關(guān)鍵詞 二苯乙烯苷;NG108-15細(xì)胞;阿爾茨海默病;Tau蛋白;磷酸化;周期蛋白依賴性激酶5;糖原合成酶激酶3β

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To observe the effects of stilbene glycosidec （TSG） on okadaic acid （OA）-induced Tau protein phosphorylation in NG108-15 cells， and to investigate the potential anti-Alzheimer’s disease （AD） mechanism of this compound. METHODS： AD model of NG108-15 cells was induced by OA. The survival rate of NG108-15 cells was observed by MTT assay after pretreated with low-dose， medium-dose and high-dose of TSG （50， 100， 200 μmol/L）. The apoptosis of NG108-15 cells was detected by AO/EB double fluorescence staining. The protein and mRNA expression of CDK5 and GSK3β， and the protein expression of Tau and p-Tau were detected by Western blotting assay and RT-PCR. The distribution of CDK5， GSK3β and Tau protein were detected by immunofluorescence. RESULTS： The normal morphology of NG108-15 cells was observed in normal control group， but CDK5， GSK3β and Tau protein were not found or few was found. Contracted or globular early apoptotic cells were observed in model gorup; the distribution of CDK5， GSK3β and Tau protein was increased， while survival rate of the cells was decreased; protein and mRNA expression of CDK5 and GSK3β as well as ratio of the relative expression of p-Tau to that of Tau （p-Tau/Tau） were all increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. After pretreatment of TSG， the distribution of early apoptotic cells as well as CDK5， GSK3β and Tau protein were all decreased to some extent in administration groups， while survival rates of the cells were increased significantly. Protein expression of CDK5 and p-Tau/Tau in medium-dose group and high-dose group as well as mRNA expression of CDK5， protein and mRNA expression of GSK3β in administration group were decreased significantly （P<0.05）. CONCLUSIONS： TSG can protect against AD model cells， the effects of which may be associated with improving survival rate of the cells， down-regulating the protein expression and gene transcription level of phosphokinase CDK5 and GSK3β， inhibiting Tau protein phosphorylation.

KEYWORDS? ?Stilbene glycoside; NG108-15 cells; Alzheimer’s disease; Tau protein; Phosphorylation; CDK5; GSK3β

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）亦稱老年性癡呆，是一種以近期記憶障礙為主要臨床癥狀，β淀粉樣蛋白沉積致老年斑、Tau蛋白過度磷酸化致神經(jīng)元纖維纏結(jié)以及神經(jīng)元丟失伴膠質(zhì)細(xì)胞增生為特征性病理改變的一種進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病[1]。其中，Tau蛋白為一種磷酸蛋白，其磷酸化程度是體內(nèi)多種磷酸化特異性蛋白激酶和脫磷酸化蛋白磷酸酶相互作用平衡的結(jié)果[2]。在正常情況下，大部分Tau蛋白是不會(huì)被磷酸化的，但在AD或其他Tau病變（如進(jìn)行性核上性麻痹、慢性創(chuàng)傷性腦病[3-4]等）患者大腦中，Tau蛋白被過度磷酸化[5]。由此可見，Tau蛋白磷酸化異常在AD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要的作用，調(diào)節(jié)Tau蛋白表達(dá)及其磷酸化水平可能成為干預(yù)AD進(jìn)展的有效手段之一。

2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷是一種多羥基酚類化合物，簡稱二苯乙烯苷（TSG）。該化合物分子式為C20H22O9，分子量為406.39，是中藥何首烏的主要生物活性成分[6]。有研究指出，TSG具有保護(hù)神經(jīng)、提高學(xué)習(xí)記憶力、抗衰老、防治AD、舒張血管、保護(hù)肝臟、降血脂、抗炎、抗腫瘤等藥理活性[7]。本研究通過岡田酸（OA）誘導(dǎo)致NG108-15細(xì)胞Tau蛋白異常磷酸化，模擬AD的發(fā)病機(jī)制以建立AD細(xì)胞模型，考察了TSG對AD發(fā)病關(guān)鍵物質(zhì)Tau蛋白及其磷酸化水平的影響，以期揭示該化合物抗AD的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支持。

1 材料

1.1 儀器

3111型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、Nanodrop3000型微量核酸蛋白分析儀、Micro17R型高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific公司）;Spectra Max Plus 384型連續(xù)光譜掃描式酶標(biāo)儀（香港分子儀器公司）;7300型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（美國ABI公司）;CKX-41型熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）;Odyssey SA型雙色紅外熒光掃描成像系統(tǒng)（美國LI-COR公司）。

1.2 藥品與試劑

TSG對照品（批號(hào)：#017M4703V，純度：≥98%）、OA（批號(hào)：#SLBS1501V）均購自美國Sigma公司;DMEM高糖培養(yǎng)基（美國Gibco公司，批號(hào)：8116486）;胎牛血清（澳大利亞AusGenex公司，批號(hào)：FBSSA00418-2）;MTT試劑（合肥白鯊生物科技有限公司，批號(hào)：2016106）;兔源Tau多克隆抗體（批號(hào)：00036062）、兔抗小鼠周期蛋白依賴性激酶5（CDK5）單克隆抗體（批號(hào)：00032730）、兔抗小鼠糖原合成酶激酶3β（GSK3β）單克隆抗體（批號(hào)：00041503）、兔抗小鼠β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體（批號(hào)：00057922）均購自美國Proteinech Group公司;兔抗小鼠磷酸化Tau（p-Tau）單克隆抗體（美國Cell Signaling公司，批號(hào)：1）;山羊抗兔IgG二抗（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)：C70620-05）;Western一抗稀釋液（批號(hào)：082118180821）、Western二抗稀釋液（批號(hào)：061418180703）均購自碧云天生物技術(shù)公司;Trizol試劑（批號(hào)：AA7101-1）、PCR試劑盒（含TBⅡ? Premix Ex TaqⅡ、ROX Reference Dye等試劑，批號(hào)：AI1777A）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：AI12361A）均購自寶生物工程（大連）有限公司，CDK5、GSK3β、甘油醛-3-硫酸脫氫酶（GAPDH）擴(kuò)增引物均由寶生物工程（大連）有限公司設(shè)計(jì)、合成;十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液（上海雅酶生物科技有限公司，批號(hào)：2017042415）;磷酸酶抑制劑（北京康為世紀(jì)生物科技公司，批號(hào)：20351）;抗熒光淬滅封片劑[生工生物工程（上海）股份有限公司，批號(hào)：D105FA0005];青鏈霉素混合液（批號(hào)：20170929）、胰蛋白酶消化液（批號(hào)：20181109）、RIPA高效快速裂解液（批號(hào)：20171021）、苯甲基磺酰氟（PMSF）（批號(hào)：20161025）、吖啶橙/溴乙錠（AO/EB）染色試劑（AO、EB試劑體積比為1 ∶ 1，批號(hào)：20161029）、Triton X-100試劑（批號(hào)：524A0510）、封閉用山羊血清（BSA，批號(hào)：1206C052）、4′，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（DAPI）試劑（批號(hào)：20170927）均購自北京索萊寶科技有限公司;其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 細(xì)胞

大、小鼠神經(jīng)瘤混合細(xì)胞NG108-15購自廣州新晉生物科技有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

將NG108-15細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)基（以下簡稱“完全培養(yǎng)基”）于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件下同），每天觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。待細(xì)胞融合至85%后，用胰蛋白酶消化、吹打，以800 r/min離心5 min，棄去上清液，沉淀加入完全培養(yǎng)基適量，反復(fù)吹打使之成為單細(xì)胞懸液，并分裝至2～3個(gè)培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。

2.2 AD細(xì)胞模型復(fù)制

采用OA誘導(dǎo)。取對數(shù)生長期的NG108-15細(xì)胞適量，以適宜密度接種至培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h。吸棄上清液，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4，下同）清洗3次后，加入以完全培養(yǎng)基配制的80 nmol/L OA溶液（濃度根據(jù)本課題組前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果確定），繼續(xù)培養(yǎng)24 h以復(fù)制AD細(xì)胞模型。

2.3 細(xì)胞增殖情況檢測

采用MTT法檢測。取對數(shù)生長期的NG108-15細(xì)胞適量，以6×104個(gè)/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞隨機(jī)分為正常對照組、模型組和TSG低、中、高劑量組（50、100、200 μmol/L，劑量設(shè)置參考本課題組前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果），每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。吸棄各孔上清液，正常對照組加入完全培養(yǎng)基1 mL，各給藥組加入含相應(yīng)藥物的完全培養(yǎng)基1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。除正常對照組外，其余各組均按“2.2”項(xiàng)下方法復(fù)制AD細(xì)胞模型。隨后每孔加入5 mg/L的MTT溶液10 μL，避光孵育4 h，棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜100 μL，室溫振蕩10 min，使用連續(xù)光譜掃描式酶標(biāo)儀于490 nm波長處檢測各孔的光密度（OD）值，并計(jì)算細(xì)胞生存率，生存率（%）=（試驗(yàn)組細(xì)胞平均OD值/正常對照組細(xì)胞平均OD值）×100%。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 細(xì)胞凋亡情況檢測

采用AO/EB雙染色法檢測。取對數(shù)生長期的NG108-15細(xì)胞適量，以4×105個(gè)/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h。按“2.3”項(xiàng)下方法分組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。正常對照組加入完全培養(yǎng)基5 mL，各含藥組加入含相應(yīng)藥物的完全培養(yǎng)基5 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。除正常對照組外，其余各組均按“2.2”項(xiàng)下方法復(fù)制AD細(xì)胞模型。隨后用PBS清洗2次，每孔加入AO/EB染色試劑20 μL和PBS 1 mL，混勻，避光孵育2～5 min后，使用熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況，并拍照[活細(xì)胞（VE）：核染色質(zhì)著綠色，且結(jié)構(gòu)正常;早期凋亡細(xì)胞（VA）：核染色質(zhì)著綠色，呈固縮或圓珠狀]。

2.5 CDK5、GSK3β、Tau、p-Tau蛋白表達(dá)情況檢測

采用Western blotting法檢測。取對數(shù)生長期的NG108-15細(xì)胞適量，以6×105個(gè)/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h。按“2.3”項(xiàng)下方法分組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。正常對照組加入完全培養(yǎng)基1 mL，各含藥組加入含相應(yīng)藥物的完全培養(yǎng)基1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。除正常對照組外，其余各組均按“2.2”項(xiàng)下方法復(fù)制AD細(xì)胞模型。隨后吸棄上清液，用PBS清洗2次，加入蛋白裂解液（RIPA高效快速裂解液、PMSF、磷酸酶抑制劑按體積比100 ∶ 1 ∶ 1配制）150 μL，于冰上裂解30 min，收集上清液，于4 ℃下以12 000 r/min離心15 min，取上清液，使用微量核酸蛋白分析儀測定蛋白濃度。蛋白經(jīng)5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液稀釋后，于95～100 ℃變性5 min。取變性蛋白適量行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后濕法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，用TBST溶液清洗5 min×3次，加入相應(yīng)一抗[內(nèi)參（β-actin）的稀釋度為1 ∶ 5 000，其余蛋白的稀釋度均為1 ∶ 1 000]，4 ℃孵育過夜;用TBST溶液清洗5 min×3次，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 10 000），37 ℃搖床避光孵育2 h，用TBST溶液清洗5 min×3次后，采用雙色紅外熒光掃描成像系統(tǒng)成像并使用ImageJ V1.48u軟件進(jìn)行定量分析，以相應(yīng)蛋白與內(nèi)參條帶的灰度值比值表示該蛋白的相對表達(dá)量。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 CDK5、GSK3β mRNA表達(dá)情況檢測

采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法（RT-PCR）檢測。取對數(shù)生長期的NG108-15細(xì)胞適量，以6×105個(gè)/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h。按“2.3”項(xiàng)下方法分組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。正常對照組加入完全培養(yǎng)基1 mL，各含藥組加入含相應(yīng)藥物的完全培養(yǎng)基1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。除正常對照組外，其余各組均按“2.2”項(xiàng)下方法復(fù)制AD細(xì)胞模型。隨后采用Trizol法抽提細(xì)胞總RNA，使用微量核酸蛋白分析儀檢測RNA濃度及純度（即A260 nm/A280 nm;當(dāng)A260 nm/A280 nm為1.8～2.1，表明RNA的純度較高），將提取的RNA按試劑盒步驟進(jìn)行去DNA和逆轉(zhuǎn)錄后，采用兩步法以實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系（共20 μL）：上/下引物（引物序列見表1）各0.8 μL、模板cDNA 2 μL、2×TBⅡ? Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL、50×ROX Reference Dye 0.4 μL、無酶水6 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s，60 ℃延伸31 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各目的mRNA的相對表達(dá)量（Ct表示每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 CDK5、GSK3β、Tau蛋白分布情況檢測

采用免疫熒光法檢測。取對數(shù)生長期的NG108-15細(xì)胞適量，以4×105個(gè)/孔接種于6孔板中（培養(yǎng)板中有玻片），培養(yǎng)24 h。按“2.3”項(xiàng)下方法分組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。正常對照組加入完全培養(yǎng)基1 mL，各含藥組加入含相應(yīng)藥物的完全培養(yǎng)基1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。除正常對照組外，其余各組均按“2.2”項(xiàng)下方法復(fù)制AD細(xì)胞模型。隨后吸棄各孔上清液，用PBS清洗5 min×3次。將細(xì)胞置于4%多聚甲醛溶液中固定20 min，用PBS清洗5 min×3次，于0.2%Triton X-100試劑中靜置5 min，用PBS清洗5 min×3次，用5%BSA-PBS混合溶液封閉30 min，把裝有玻片的培養(yǎng)板放于自制濕盒中，室溫孵育1 h后，吸棄多余液體。在玻片上滴加相應(yīng)一抗（CDK5、GSK3β、Tau的稀釋度分別為1 ∶ 500、1 ∶ 300、1 ∶ 200），4 ℃孵育過夜，用PBS清洗5 min×3次，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 1 000），室溫避光孵育1 h，用PBS清洗5 min×3次，加入DAPI試劑50 μL，室溫避光孵育5 min。取出玻片，晾干，加入抗熒光淬滅封片劑適量，于熒光倒置顯微鏡下觀察目標(biāo)蛋白的分布情況（目標(biāo)蛋白呈綠色熒光，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光）。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 TSG對AD模型細(xì)胞存活情況的影響

與正常對照組比較，模型組細(xì)胞的存活率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，TSG各劑量組細(xì)胞的存活率均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），詳見表2。

3.2 TSG對AD模型細(xì)胞凋亡情況的影響

正常對照組可見大量VE，呈綠色，且形態(tài)未見異常。模型組可見部分VA，呈固縮或圓珠狀;經(jīng)TSG預(yù)處理后，各給藥組VA均有所減少，詳見圖1（圖中，“圓圈”表示VE，“箭頭”表示VA）。

3.3 TSG對AD模型細(xì)胞CDK5、GSK3β、Tau、p-Tau蛋白表達(dá)的影響

與正常對照組比較，模型組細(xì)胞CDK5、GSK3β的相對表達(dá)量以及p-Tau與Tau相對表達(dá)量的比值（p-Tau/Tau）均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，TSG中、高劑量組細(xì)胞CDK5的相對表達(dá)量和p-Tau/Tau以及各劑量組細(xì)胞GSK3β的相對表達(dá)量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），詳見圖2、表3。

3.4 TSG對AD模型細(xì)胞CDK5、GSK3β mRNA表達(dá)的影響

與正常對照組比較，模型組細(xì)胞CDK5、GSK3β mRNA的相對表達(dá)量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，TSG各劑量組細(xì)胞CDK5、GSK3β mRNA的相對表達(dá)量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），詳見表4。

3.5 TSG對AD模型細(xì)胞CDK5、GSK3β、Tau分布的影響

正常對照組細(xì)胞中，未見或少見CDK5、GSK3β、Tau蛋白分布。模型組細(xì)胞中，CDK5、GSK3β、Tau蛋白分布明顯增多。經(jīng)TSG預(yù)處理后，各給藥組細(xì)胞中CDK5、GSK3β、Tau蛋白的分布均有不同程度的減少，詳見圖3～圖5（圖中，“箭頭”表示目標(biāo)蛋白）。

4 討論

AD作為一種進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，其主要的神經(jīng)病理性特征包括β淀粉樣蛋白沉積所導(dǎo)致的老年斑、Tau蛋白過度磷酸化造成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)以及神經(jīng)元丟失伴膠質(zhì)細(xì)胞增生[1]?，F(xiàn)有研究證實(shí)，AD的發(fā)生與β淀粉樣蛋白、Tau蛋白有關(guān)，且后者的異常磷酸化可導(dǎo)致AD患者的認(rèn)知障礙[8-9]。因此，抑制和調(diào)控Tau蛋白的磷酸化可能是預(yù)防和治療AD的關(guān)鍵。

TSG是我國傳統(tǒng)中藥何首烏的主要活性成分。研究表明，該化合物具有抗氧化、抗衰老、防治AD、提高DNA修復(fù)功能等作用[6-7]。本課題組前期以淀粉樣前體蛋白（APP）/早老蛋白1（PS1）雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠為對象，發(fā)現(xiàn)TSG能有效改善其學(xué)習(xí)記憶功能，但具體機(jī)制尚不清楚[10]。NG108-15細(xì)胞是神經(jīng)瘤細(xì)胞，具有與神經(jīng)元細(xì)胞相似的生理結(jié)構(gòu)和形態(tài)特點(diǎn)，能較好地模擬AD的病理過程[11]。因此，本研究通過OA誘導(dǎo)NG108-15細(xì)胞Tau蛋白異常磷酸化以建立AD模型，初步探討TSG對Tau蛋白磷酸化水平的影響及可能機(jī)制。

Tau蛋白的異常磷酸化是AD的重要病理特征之一，可引發(fā)神經(jīng)毒性反應(yīng)，從而破壞神經(jīng)元細(xì)胞骨架的正常生理功能[12]。在病理狀態(tài)下，Tau聚集可導(dǎo)致神經(jīng)元死亡進(jìn)而造成認(rèn)知障礙[13]。本研究結(jié)果顯示，模型組可見固縮或圓珠狀的VA和聚集的Tau蛋白，其細(xì)胞存活率較正常對照組顯著降低，p-Tau/Tau較正常對照組顯著升高，提示OA可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞Tau蛋白的異常磷酸化，增加Tau蛋白的聚集，最終造成細(xì)胞凋亡。經(jīng)TSG預(yù)處理后，各給藥組VA和Tau蛋白均有不同程度的減少，各劑量組細(xì)胞的存活率均較模型組顯著升高，中、高劑量組細(xì)胞p-Tau/Tau均較模型組顯著降低，提示TSG可抑制OA誘導(dǎo)的Tau磷酸化，并減少Tau蛋白的聚集和細(xì)胞的凋亡。

CDK5和GSK3β已被確定為引發(fā)神經(jīng)退行性疾病Tau蛋白異常磷酸化的主要蛋白激酶[14-15]。其中，CDK5是調(diào)控Tau蛋白磷酸化的重要激酶，可引起Tau蛋白11個(gè)磷酸化位點(diǎn)的磷酸化，與神經(jīng)元遷移、細(xì)胞黏附、突觸活化、多巴胺傳遞等信號(hào)通路底物作用有關(guān)，是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及功能維持的必需蛋白之一[16];GSK3β可加重神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，增加β淀粉樣蛋白的生成，并降低AD患者體內(nèi)乙酰膽堿的合成，造成神經(jīng)元丟失，與Tau蛋白磷酸化過程、細(xì)胞凋亡及患者記憶障礙密切相關(guān)[17-19]。本研究結(jié)果顯示，正常對照組細(xì)胞未見或少見CDK5、GSK3β蛋白分布。經(jīng)OA誘導(dǎo)后，模型組細(xì)胞CDK5、GSK3β蛋白分布明顯增多，CDK5、GSK3β蛋白及其mRNA的相對表達(dá)量均較正常對照組顯著升高，提示細(xì)胞Tau磷酸化異?？赡芘cCDK5、GSK3β蛋白表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)。經(jīng)TSG預(yù)處理后，各給藥組細(xì)胞CDK5、GSK3β蛋白分布有所減少，中、高劑量組細(xì)胞CDK5蛋白以及各劑量組CDK5 mRNA、GSK3β蛋白及其mRNA的相對表達(dá)量均較模型組顯著降低，提示TSG對Tau磷酸化的調(diào)控作用可能是通過抑制CDK5、GSK3β蛋白的表達(dá)及其mRNA的轉(zhuǎn)錄來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，TSG可下調(diào)相關(guān)磷酸激酶的蛋白表達(dá)和基因轉(zhuǎn)錄水平，抑制Tau蛋白的磷酸化，提高細(xì)胞存活率，對AD模型細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。但TSG與Tau蛋白磷酸化相關(guān)蛋白磷酸激酶間的相互作用機(jī)制尚有待后續(xù)研究進(jìn)一步完善。

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（收稿日期：2018-12-23 修回日期：2019-06-28）

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