張麗 蔡進(jìn) 班玉娟 朱高峰 陳瑞 王建塔 湯磊 黃靜

摘 要 建立測定肝微粒體孵育體系中樹豆酮酸A（CAA）質(zhì)量濃度的方法，并比較其在不同種屬肝微粒體中的代謝特征。方法：分別將CAA溶解于由還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）啟動(dòng)的大鼠、比格犬、人肝微粒體孵育體系中，置于37 ℃水浴中進(jìn)行孵育，分別于孵育的0、5、10、15、30、45、60 min時(shí)用乙腈終止反應(yīng)，以染料木素為內(nèi)標(biāo)，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）檢測各孵育體系中CAA的質(zhì)量濃度。色譜柱為Waters BEH C18，流動(dòng)相為水（含0.1%甲酸）-乙腈（含0.1%甲酸）（45 ∶ 55，V/V），流速為0.25 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為2 μL;采用電噴霧離子源，以選擇反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行負(fù)離子掃描，用于定量分析的離子對分別為m/z 353.14→309.11（CAA）、m/z 269.86→224.11（內(nèi)標(biāo)）。以孵育0 min時(shí)CAA的質(zhì)量濃度為參照，計(jì)算其在不同孵育體系中的剩余百分比和酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果：CAA檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為0.05～20 μg/mL，定量下限為0.05 μg/mL，最低檢測限為0.01 μg/mL;日內(nèi)、日間RSD均小于10%，相對誤差為-4.83%～8.94%，提取方法和基質(zhì)效應(yīng)均不影響待測物的測定。孵育60 min時(shí)，CAA在大鼠、比格犬、人肝微粒體中的剩余百分比分別為（62.79±9.99）%、（64.07±11.59）%、（96.66±5.71）%;在大鼠、比格犬肝微粒體中的半衰期（72.19、68.61 min）均顯著短于人肝微粒體（364.74 min），清除率[0.019 2、0.020 2 mL/（min·mg）]均顯著高于人肝微粒體[0.003 8 mL/（min·mg）]（P<0.05）。結(jié)論：本研究建立的UPLC-MS/MS法簡便、快速、專屬性強(qiáng)、靈敏度高，可用于肝微粒體孵育體系中CAA質(zhì)量濃度的測定及體外代謝穩(wěn)定性的研究。CAA在大鼠、比格犬肝微粒體中的代謝穩(wěn)定性均差于人肝微粒體。

關(guān)鍵詞 樹豆酮酸A;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;肝微粒體;不同種屬;體外代謝穩(wěn)定性

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish a determination method for the concentration of cajanonic acid A （CAA） in liver microsome incubation system， and to compare the metabolism characteristics of it in different species of liver microsomes. METHODS： CAA was dissolved in liver microsome incubation system of rat， Beagle dog and human initiated by reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate （NADPH）， and was incubated in water at 37 ℃. The reaction was terminated with acetonitrile at 0， 5， 10， 15， 30， 45 and 60 min， respectively. Using genistein as internal standard， the concentration of CAA in? different incubation systems was determined by UPLC-MS/MS. The determination was performed on Waters BEH C18 column with mobile phase consisted of water （containing 0.1% formic acid）-acetonitrile （containing 0.1% formic acid） （45 ∶ 55， V/V） at the flow rate of 0.25 mL/min. The column temperature was 30 ℃， and the sample size was 2 μL. The electrospray ionization source was used to the select reaction monitoring mode for negative ion scanning. The ion pairs for quantitative analysis were m/z 353.14→309.11 （CAA）， m/z 269.86→224.11 （internal standard） respectively. The residual percentage and enzymatic kinetic parameters of CAA in different incubation systems were calculated according to the mass concentration of CAA at 0 min. RESULTS： The linear range of CAA was 0.05-20 μg/mL; the limit of quanti- tation was 0.05 μg/mL， and the lowest detection limit was 0.01 μg/mL. RSDs of intra-day and inter-day were lower than 10%; relative errors ranged -4.83%-8.94%; extraction method and matrix effect did not affect the determination of the substance to be measured. At 60 min of incubation， residual percentages of CAA in rat， Beagle dog and human liver microsomes were（62.79±9.99）%，（64.07±11.59）%，（96.66±5.71）%， respectively. The half-life period （72.19， 68.61 min） of CAA in rat and Beagle dog liver microsomes were significantly shorter than human liver microsome （364.74 min）. The clearance rates [0.019 2， 0.020 2 mL/（min·mg）] were significantly higher than human liver microsome [0.003 8 mL/（min·mg）] （P<0.05）. CONCLUSIONS： Established UPLC-MS/MS method is simple， rapid， specific and sensitive， and can be used for the determination of CAA concentration in liver microsome incubation system and the study of metabolism stability in vitro. The stability of CAA metabolism in rat and Beagle dog liver microsomes are poorer than human liver microsome.

KEYWORDS? ?Cajanonic acid A; UPLC-MS/MS; Liver microsomes; Different species;? Metabolism stability in vitro

樹豆酮酸A（Cajanonic acid A，CAA;結(jié)構(gòu)式見圖1）是從豆科植物樹豆[Cajanus cajan （Linn.） Millsp.]葉中分離出的一種新的菧類化合物[1-2]。已有體內(nèi)外研究證實(shí)，CAA作為肥胖癥特異性靶點(diǎn)蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）抑制劑，可明顯提高胰島素抵抗脂肪細(xì)胞對葡萄糖的吸收量，并可降低先天肥胖型小鼠的體質(zhì)量和空腹血糖水平、提高其葡萄糖耐受量，具有開發(fā)成糖尿病治療藥物的潛力和價(jià)值[3-4]。

細(xì)胞色素P450（CYP）酶是藥物Ⅰ相代謝的重要酶系，主要存在于肝微粒體中，在藥物生物轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[5-6]。在新藥研發(fā)的早期階段，研究者可通過表征藥物在體外不同種屬肝微粒體中的代謝穩(wěn)定性和代謝轉(zhuǎn)化行為來分析其代謝差異[7-8]。鑒于此，本研究建立了測定肝微粒體中CAA質(zhì)量濃度的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS），計(jì)算并比較了該化合物在大鼠、比格犬和人肝微粒體中的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)[消除半衰期（t1/2）、體外清除率（CLint）]，旨在為CAA的體內(nèi)代謝研究提供參考，為其后續(xù)藥效學(xué)及臨床研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

UltiMate 3000型UPLC-TSQ Endura型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（ESI）和Xcalibur v2.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國Thermo Finnigan公司）;JN300-2型氮?dú)獯祾邇x（蘇州吉米諾儀器有限公司）;X1型高速離心機(jī)（香港基因有限公司）;KH-600E型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）;FA805N型十萬分之一電子天平（上海菁海儀器有限公司）;DW-86L486型超低溫保存箱（青島海爾股份有限公司）。

1.2 藥品與試劑

CAA對照品（貴州醫(yī)科大學(xué)藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備，批號：20180521，純度：>98%）;染料木素對照品（內(nèi)標(biāo)，批號：528C021，純度：>98%）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二鈉（NADP-Na2，批號：718B0225）、葡萄糖-6-磷酸-二鈉（G-6-P-Na2，批號：116B039）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-P-DH，批號：20160725）均購自北京索萊寶科技有限公司;雄性SD大鼠肝微粒體（批號：M10017. 2017002）、雄性比格犬肝微粒體（批號：M10007. 2017002）、人肝微粒體（男性健康蒙古利亞人種，批號：M10001.2017003）均購自武漢普萊特生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，質(zhì)量濃度均為20 g/L（以蛋白計(jì)）;甲酸、甲醇、乙腈均為色譜純，氯化鎂、檸檬酸鈉等其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 CAA和內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取CAA對照品適量，用甲醇溶解并定容，制得質(zhì)量濃度為1 mg/L的CAA貯備液;同法制得質(zhì)量濃度為1 mg/L的內(nèi)標(biāo)貯備液;上述貯備液均置于4 ℃保存，備用。臨用前，將CAA貯備液與適量甲醇、0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4;下同）、肝微粒體、輔酶溶液等混合，制備孵育體系;將內(nèi)標(biāo)貯備液用甲醇稀釋，制得質(zhì)量濃度為2 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.1.2 還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）輔酶溶液 A液：依次加入NADP-Na2、G-6-P-Na2、氯化鎂200、200、133 mg，用水定容至10 mL。B液：依次加入檸檬酸鈉、G-6-P-DH 44 mg、1 000 U，用水定容至25 mL。將A、B液均置于-20 ℃保存，備用。臨用前，將A、B液按體積比5 ∶ 1混合，制得濃度為1 mmol/L（按反應(yīng)產(chǎn)物NADPH計(jì)）的輔酶溶液[9]。

2.2 樣品孵育與處理

2.2.1 孵育體系的建立 取大鼠、比格犬、人肝微粒體各適量，用PBS稀釋至0.5 g/L，隨后加入“2.1.1”項(xiàng)下CAA貯備液適量，使CAA最終質(zhì)量濃度為5 μg/mL，同時(shí)確保孵育體系中甲醇的含量不超過1%。將上述溶液置于37 ℃水浴中靜置5 min后，加入“2.1.2”項(xiàng)下NADPH輔酶溶液以啟動(dòng)反應(yīng)。該體系總體積為200 μL，其中NADPH的終濃度為1 mmol/L，有機(jī)溶劑不超過5%[10-11]。

2.2.2 樣品孵育與處理 將上述孵育體系繼續(xù)置于37 ℃水浴中進(jìn)行孵育，分別于孵育0、5、10、15、30、45、60 min時(shí)，加入含內(nèi)標(biāo)（2 μg/mL）的乙腈400 μL終止反應(yīng)，渦旋混勻30 s，于4 ℃下以16 000×g離心10 min，取上清液以氮?dú)饬鞔蹈?，殘?jiān)眉状?00 μL復(fù)溶，再以16 000×g離心10 min，取上清液適量進(jìn)行UPLC-MS/MS分析，考察各時(shí)間點(diǎn)待測物的含量[12]。各孵育體系均平行操作3次。

2.3 UPLC-MS/MS定量分析

2.3.1 色譜與質(zhì)譜條件 色譜柱：Waters BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）;保護(hù)柱：Waters VanGuard BEH C18（5 mm×2.1 mm，1.7 μm）;流動(dòng)相：水（含0.1%甲酸）-乙腈（含0.1%甲酸）（45 ∶ 55，V/V）;流速：0.25 mL/min;柱溫：30 ℃;進(jìn)樣量：2 μL;采集時(shí)間：6 min。電離源：ESI;掃描模式：選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）模式;掃描方式：負(fù)離子掃描;噴霧電壓：2 963.64 V;氣化溫度：270 ℃;氣簾氣壓力：25 psi;用于定量分析的離子對：m/z 353.14→309.11（CAA，透射電壓：164.39 V，碰撞能：17.13 eV）、m/z 269.86→224.11（內(nèi)標(biāo)，透射電壓：181.03 V，碰撞能：24 eV）。

2.3.2 專屬性 分別取空白孵育樣品（不含待測物和內(nèi)標(biāo)，以經(jīng)高溫滅活的大鼠肝微粒為介質(zhì)，按“2.2”項(xiàng)下方法制得）、CAA對照樣品（含待測物5 μg/mL和內(nèi)標(biāo)2 μg/mL，以經(jīng)高溫滅活的大鼠肝微粒為介質(zhì)，按“2.2”項(xiàng)下方法制得）、孵育15 min時(shí)的樣品（大鼠肝微粒體，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理）各適量，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果，內(nèi)標(biāo)和CAA的色譜峰峰形良好，其保留時(shí)間分別約為0.79、3.61 min，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測物的測定，表明該方法專屬性好，詳見圖2。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、定量下限、最低檢測限的考察 取“2.1.1”項(xiàng)下CAA貯備液適量，加至經(jīng)高溫滅活的大鼠肝微粒體孵育體系（0.2 mL）中，制得CAA質(zhì)量濃度分別為0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、10、20 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線對照溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法孵育15 min并處理，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以待測物質(zhì)量濃度（c，μg/mL）為橫坐標(biāo)、待測物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（y）為縱坐標(biāo)，采用加權(quán)最小二乘法（加權(quán)系數(shù)為1/c）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=12.98c+0.92（R2=0.997 3）。結(jié)果，CAA檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為0.05～20 μg/mL，定量下限為0.05 μg/mL（信噪比為10 ∶ 1），最低檢測限為0.01 μg/mL（信噪比為3 ∶ 1）。

2.3.4 準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn) 按“2.3.3”項(xiàng)下方法配制CAA定量下限質(zhì)量濃度（0.05 μg/mL）樣品以及低、中、高質(zhì)量濃度（0.1、2.5、10 μg/mL）質(zhì)控（QC）樣品各5份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法孵育15 min并處理，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，考察日內(nèi)精密度;連續(xù)測定3 d，考察日間精密度。將實(shí)測質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度進(jìn)行比較，以相對誤差（RE）來考察準(zhǔn)確度。結(jié)果，CAA定量下限質(zhì)量濃度以及低、中、高質(zhì)量濃度QC樣品的日內(nèi)、日間RSD均小于10%，RE為-4.83%～8.94%，符合生物樣品定量分析的相關(guān)要求[13]，詳見表1。

2.3.5 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn) 按“2.3.3”項(xiàng)下方法配制低、中、高質(zhì)量濃度（0.1、2.5、10 μg/mL）QC樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法孵育15 min并處理，進(jìn)樣分析，記錄峰面積（A1）;按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備經(jīng)滅活的大鼠肝微粒體孵育體系適量，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法孵育15 min并處理，隨后加入CAA貯備液適量，使最終質(zhì)量濃度與上述QC樣品對應(yīng)，進(jìn)樣分析，記錄峰面積（A2）;以甲醇配制相應(yīng)質(zhì)量濃度且不含輔酶溶液的樣品溶液，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法孵育15 min并處理，進(jìn)樣分析，記錄峰面積（A3）。各質(zhì)量濃度平行操作5份。提取回收率=（A1/A2）×100%，基質(zhì)效應(yīng)=（A2/A3）×100%。結(jié)果，CAA低、中、高質(zhì)量濃度QC樣品的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)均符合生物樣品定量分析的相關(guān)要求[13]，表明提取方法、基質(zhì)效應(yīng)均不影響待測物的定量分析，詳見表2。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.3.3”項(xiàng)下方法配制CAA低、中、高質(zhì)量濃度（0.1、2.5、10 μg/mL）QC樣品各5份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法孵育15 min并處理后，考察其在自動(dòng)進(jìn)樣器（8 ℃）內(nèi)放置6 h、室溫放置12 h、4 ℃冷藏12 h、反復(fù)凍融（-80 ℃～常溫）3次的穩(wěn)定性。結(jié)果，各樣品實(shí)測質(zhì)量濃度的RSD均小于10%，表明其在上述條件下穩(wěn)定性良好，詳見表3。

2.4 CAA在大鼠、比格犬、人肝微粒體中的代謝穩(wěn)定性研究

按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行體外代謝穩(wěn)定性研究，采用底物消除法考察CAA的代謝情況。以CAA孵育0 h時(shí)的質(zhì)量濃度為參照，其余時(shí)間點(diǎn)的質(zhì)量濃度與之相比計(jì)算底物剩余百分比。上述試驗(yàn)平行操作3次。使用GraphPad Prism v7.0軟件繪制CAA在不同種屬肝微粒體孵育體系中的平均剩余百分比-時(shí)間曲線，結(jié)果見圖3（由于其余時(shí)間點(diǎn)的實(shí)測值可能大于0 h時(shí)的實(shí)測值，故剩余百分比可能超過100%）。

將各時(shí)間點(diǎn)的平均剩余百分比的自然對數(shù)對孵育時(shí)間作線性回歸，求得斜率（k），根據(jù)公式①②計(jì)算酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)（t1/2、CLint）[14-15]：

參照如下標(biāo)準(zhǔn)判斷CAA在不同種屬肝微粒體中的代謝穩(wěn)定性：t1/2<30 min，表明受試物代謝不穩(wěn)定;t1/2為30～90 min，表明受試物代謝穩(wěn)定性中等;t1/2>90 min，表明受試物代謝穩(wěn)定性良好[16]。使用GraphPad Prism v7.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）或t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果，在以NADPH啟動(dòng)的Ⅰ相肝微粒體孵育體系中，CAA在大鼠、比格犬肝微粒體中的代謝穩(wěn)定性一般，兩者的t1/2均顯著短于人肝微粒體，CLint均顯著高于人肝微粒體，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），詳見表4。

3 討論

肝臟是代謝的主要器官，是藥物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的重要場所。在這個(gè)復(fù)雜的生理過程中，藥物被各種代謝酶分解、轉(zhuǎn)化成不同的分子（即代謝物）以發(fā)揮其藥理活性。與體內(nèi)代謝研究相比，體外代謝研究具有成本低廉，操作方法簡便、快速，結(jié)果重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，適用于新藥研發(fā)候選化合物代謝行為的早期研究及篩選[7-8]。為此，本研究對CAA在不同種屬肝微粒體中的代謝行為進(jìn)行了初步探討。

3.1 UPLC-MS/MS條件的篩選

在建立孵育體系中CAA質(zhì)量濃度測定的UPLC- MS/MS法時(shí)，考慮到比格犬和人肝微粒體價(jià)格昂貴、研究成本較高，且不同種屬經(jīng)滅活的肝微粒體間的差異不大，故本研究以大鼠肝微粒體為介質(zhì)，進(jìn)行方法學(xué)考察。

在色譜流動(dòng)相的篩選過程中，本研究比較了乙腈和甲醇的分離效果。結(jié)果顯示，與甲醇相比，乙腈可使待測物具有更高的質(zhì)譜響應(yīng)和更低的背景噪聲，色譜峰峰形更佳，故選擇乙腈作為流動(dòng)相的有機(jī)相。此外筆者還發(fā)現(xiàn)，在流動(dòng)相中添加適量甲酸可提高待測物的電離強(qiáng)度，并可縮短CAA的保留時(shí)間，故在兩相比例優(yōu)化的基礎(chǔ)上，最終將流動(dòng)相確定為水（含0.1%甲酸）-乙腈（含0.1%甲酸）（45 ∶ 55，V/V）。

在質(zhì)譜掃描模式的考察中，本研究比較了正、負(fù)離子模式下待測物的質(zhì)譜響應(yīng)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正離子模式下，CAA基本無響應(yīng);而在負(fù)離子模式下，CAA和內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)均較強(qiáng)。因此，本研究選擇了負(fù)離子模式。

本課題組前期對槲皮素、兒茶酚、兒茶素、染料木素、葛根素、楊梅素等內(nèi)標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行了篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以染料木素為內(nèi)標(biāo)時(shí)，該化合物與CAA可基線分離，且兩者回收率均較高，故以染料木素作為CAA定量分析的內(nèi)標(biāo)。

3.2 底物濃度的選擇

在體外代謝研究中，受試底物的濃度不能太高，否則將無法保證其20%的清除率;另一方面，受試底物的濃度也不宜過低，否則底物可能在極短的時(shí)間內(nèi)就被清除完全[17-18]。為此，本課題組前期對1、5、10 μg/mL等3個(gè)質(zhì)量濃度CAA的孵育情況進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示，當(dāng)CAA的質(zhì)量濃度為5 μg/mL時(shí)，剩余藥物濃度并不太高，且大部分種屬肝微粒體中有20%的藥物被清除，故最終將孵育底物CAA的質(zhì)量濃度定為5 μg/mL。

3.3 酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)檢測方法的選擇

代謝穩(wěn)定性研究多采用產(chǎn)物生產(chǎn)法和底物消除法。其中，產(chǎn)物生產(chǎn)法考察的是單位時(shí)間內(nèi)代謝產(chǎn)物的生成量，并將產(chǎn)物生產(chǎn)速率和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行米氏方程擬合，以獲得相應(yīng)的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)，適用于代謝物已知且代謝物標(biāo)準(zhǔn)品易獲得的藥物的代謝研究;而底物消除法則是以母體化合物在不同時(shí)間點(diǎn)的消除量來反映底物的消除情況，勿需代謝物的具體信息，適用于新藥研發(fā)早前階段的代謝穩(wěn)定性研究[19]。鑒于研究成本及方法的易操作性，本研究選用了底物消除法對CAA的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)和代謝穩(wěn)定性進(jìn)行了初步考察。

3.4 CAA在不同種屬肝微粒體中的代謝特征分析

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)孵育后，CAA在3個(gè)種屬肝微粒體中的t1/2由小到大依次為比格犬（68.61 min）、大鼠（72.19 min）、人（364.75 min），CLint由小到大依次為人[0.003 8 mL/（min·mg）]、大鼠[0.019 2 mL/（min·mg）]、比格犬[0.020 2 mL/（min·mg）]，表明該化合物在比格犬和大鼠體內(nèi)代謝穩(wěn)定性一般，在人體內(nèi)代謝穩(wěn)定性良好。這提示比格犬和大鼠與人之間存在一定差異。動(dòng)物為藥物代謝行為研究提供了生理學(xué)載體，但物種間的差異可能會(huì)對人體內(nèi)代謝情況的模擬造成影響，故在選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物時(shí)應(yīng)予以關(guān)注。

綜上所述，本研究成功建立了測定大鼠肝微粒體中CAA質(zhì)量濃度的UPLC-MS/MS法，該方法簡便、快速、專屬性強(qiáng)、靈敏度高，可用于肝微粒體孵育體系中CAA質(zhì)量濃度的測定及體外代謝穩(wěn)定性的研究。CAA在大鼠、比格犬、人肝微粒體中的代謝特征有所差異，其代謝可能與Ⅰ相代謝酶有關(guān)。本課題組后續(xù)將借助高分辨質(zhì)譜、波譜等手段進(jìn)一步確證CAA的代謝產(chǎn)物，并結(jié)合體內(nèi)外研究進(jìn)一步闡明其代謝特征，以期為該化合物的開發(fā)利用提供更多參考。

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（收稿日期：2019-01-24 修回日期：2019-07-06）

（編輯：張?jiān)拢?/p>