馬昌豪　李懷偉　仝桂平　馬海春　馮思騰

中圖分類號(hào) R917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）16-2232-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.16.14

摘 要 目的：建立一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定咽炎片中芍藥苷、蘆丁、木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸等5種指標(biāo)性成分的含量。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Hypersil GOLD-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.35%磷酸水溶液（梯度洗脫），檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm（蘆丁、木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸）、230 nm（芍藥苷），柱溫為30 ℃，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。以芍藥苷為內(nèi)參物，建立蘆丁、木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸的相對(duì)校正因子;考察不同色譜系統(tǒng)、色譜柱、流動(dòng)相比例、流速、柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響，并按相對(duì)保留時(shí)間對(duì)待測(cè)成分進(jìn)行色譜峰定位。按外標(biāo)法測(cè)定內(nèi)參物芍藥苷含量，按一測(cè)多評(píng)法測(cè)定其余4種成分含量，并與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果：各待測(cè)成分的分離度均大于1.5;芍藥苷、蘆丁、木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸的質(zhì)量濃度分別在3.97～119.22、1.96～58.68、2.39～71.64、1.92～57.51、0.54～16.24 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r≥0.999 7）;精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD均小于2%;平均加樣回收率為97.20%～98.07%（RSD<3%，n=6）。以芍藥苷為內(nèi)參物，蘆丁、木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸的平均相對(duì)校正因子分別為0.554 6、1.815 6、2.489 3、5.423 2;在不同色譜條件下其相對(duì)校正因子和相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于5%。采用一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法分別測(cè)得10批咽炎片待檢樣品中4種成分（除內(nèi)參物外）含量的相對(duì)誤差絕對(duì)值均小于1%，兩種方法測(cè)定結(jié)果一致。結(jié)論：本方法準(zhǔn)確、快捷、高效、價(jià)廉，可用于同時(shí)測(cè)定咽炎片中5種指標(biāo)性成分的含量。

關(guān)鍵詞 咽炎片;一測(cè)多評(píng)法;芍藥苷;蘆丁;木蝴蝶苷B;黃芩苷;肉桂酸;高效液相色譜法;含量測(cè)定

Simultaneous Determination of the Contents of 5 Indicator Components in Yanyan Tablets by QAMS

MA Changhao， LI Huaiwei， TONG Guiping， MA Haichun， FENG Siteng （Heze Institute for Food and Drug Control， Shandong Heze 274000， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish QAMS method for content determination of paeoniflorin， rutin， oroxin B， baicalin and cinnamates in Yanyan tablets. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Hypersil GOLD-C18 column （250 mm×4.6 mm，5 μm） with mobile phase consisted of methanol-0.35% phosphoric acid solution （gradient elution） at flow rate of 1 mL/min. The detection wavelengths were set at 280 nm （rutin， oroxin B， baicalin， cinnamates） and 230 nm （paeoniflorin）. The column temperature was 30 ℃， and sample size was 10 μL. Using paeoniflorin as internal reference， relative correction factors （RCF） of rutin， oroxin B， baicalin and cinnamates were established. Effects of different chromatogram system， chromatogram column， mobile phase proportion， flow rate and column temperature on relative correction factors were investigated; the chromatographic peaks of the components were located according to the relative retention time. The content of paeoniflorin as internal reference was determined by external standard method， and the other four components were determined by QAMS， and then compared with the results of external standard method. RESULTS： The separation degree of each component to be measured was greater than 1.5. The linear range was 3.97-119.22 μg/mL for paeoniflorin，1.96-58.68 μg/mL for rutin，2.39-71.64 μg/mL for oroxin B， 1.92-57.51 μg/mL for baicalin， 0.54-16.24 μg/mL for cinnamates（r≥0.999 7）， respectively. RSDs of precision， reproducibility and stability tests were all lower than 2%. Average recoveries were 97.20%-98.07%（RSD<3%，n=6）. RCFs of rutin， oroxin B， baicalin and cinnamates were 0.554 6，1.815 6，2.489 3 and 5.423 2， using paeoniflorin as internal reference. RSDs of RCF and relative retention time were all lower than 5% under different chromatogram conditions. Absolut relative error of four components （except for internal reference） in 10 batches of Yanyan tablets sampled by QAMS and external standard method were all less than 1%. The results of the two methods were identical. CONCLUSIONS： The established method is accurate， rapid， efficient and inexpensive， and it can be used for simultaneous determination of 5 indicator components in Yanyan tablet.

KEY WORDS? ?Yanyan tablet; QAMS; Paeoniflorin; Rutin; Oroxin B; Baicalin; Cinnamates; HPLC; Content determination

咽炎片是由玄參、款冬花（制）、牡丹皮、木蝴蝶、地黃等12味藥材組方而成的口服片劑，具有養(yǎng)陰潤(rùn)肺、清熱解毒、清咽利喉、鎮(zhèn)咳止癢等作用，臨床上用于治療慢性咽炎引起的咽干、咽癢、刺激性咳嗽等[1]。該制劑配伍藥材中，玄參清熱涼血、滋陰降火，為主藥;牡丹皮清熱涼血，木蝴蝶清熱利咽，款冬花潤(rùn)肺下氣、止咳化痰，共為臣藥。已有研究分別對(duì)咽炎片中芍藥苷、黃芩苷、蘆丁、木蝴蝶苷B等成分進(jìn)行含量測(cè)定[2-5]，但由于多種成分同時(shí)測(cè)定所需的對(duì)照品較多，而部分對(duì)照品價(jià)格高昂，導(dǎo)致檢驗(yàn)成本較高。一測(cè)多評(píng)法（Quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）是指以樣品中某一個(gè)典型組分為內(nèi)參物，建立該組分與其他組分之間的相對(duì)校正因子，再通過(guò)相對(duì)校正因子計(jì)算其他組分含量的方法[6-7]，可較好地解決多種成分同時(shí)測(cè)定時(shí)對(duì)照品消耗多、檢驗(yàn)成本高的問(wèn)題。該方法已經(jīng)成功應(yīng)用于多種藥材和制劑的質(zhì)量控制[8-13]，且2015年版《中國(guó)藥典》（一部）[14]也已收載該方法?；诖?，結(jié)合咽炎片組方特點(diǎn)，以牡丹皮中的芍藥苷，款冬花中的蘆丁，木蝴蝶中的木蝴蝶苷B、黃芩苷和玄參中的肉桂酸為指標(biāo)性成分，采用QAMS法同時(shí)測(cè)定咽炎片中上述5種成分的含量，為進(jìn)一步完善咽炎片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及有效控制其產(chǎn)品質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀、1200型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）;LC-2030型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）;XS-105型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）;KQ3200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;Milli-Q型超純水機(jī)（德國(guó)Merck公司）。

1.2 藥品與試劑

芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-201842，純度：97.4%）、蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100080-201409，純度：91.7%）、木蝴蝶苷B對(duì)照品（批號(hào)：111915-201603，純度：91.9%）、黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)：111715-201720，純度：93.5%）、肉桂酸對(duì)照品（批號(hào)：110786-201604，純度：98.8%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;甲醇（色譜純，德國(guó)艾普力公司）;磷酸（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）;水為超純水。

咽炎片標(biāo)準(zhǔn)樣品（編號(hào)：S1）由本課題組按照該制劑處方工藝自制;10批咽炎片待檢樣品來(lái)自山東省藥品風(fēng)險(xiǎn)質(zhì)量監(jiān)測(cè)抽檢廠家，樣品信息詳見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18（250 mm×4.6 mm，5? ? μm）;流動(dòng)相：甲醇（A）-0.35%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～25 min，30%A;25～50 min，30%A→43%A;50～70 min，43%A→45%A;70～85 min，45%A→30%A）;檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm（蘆丁、木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸）、230 nm（芍藥苷）;柱溫：30 ℃;流速：1 mL/min;進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別取芍藥苷、蘆丁、木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸各對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇適量使溶解，制成上述5種成分質(zhì)量濃度分別為0.198 7、0.097 8、0.238 8、0.191 7、0.108 3 mg/mL的單一對(duì)照品貯備液;精密量取上述各貯備液適量，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇稀釋制成上述5種成分質(zhì)量濃度分別為39.74、19.56、23.88、19.17、5.42 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取樣品20片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，混勻;取藥粉約4 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率：150 W，頻率：40 kHz，下同）處理30 min，冷卻至室溫，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 參照咽炎片處方配料比，制備同時(shí)缺少牡丹皮、款冬花、木蝴蝶、玄參的陰性對(duì)照樣品。取該樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液（編號(hào)：S1）和陰性對(duì)照溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，理論板數(shù)按黃芩苷和木蝴蝶苷B峰計(jì)均不低于5 000，各色譜峰的分離度均大于1.5，陰性對(duì)照溶液對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，色譜圖詳見(jiàn)圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下黃芩苷對(duì)照品貯備液0.10、0.30、0.50、1.00、2.00、3.00 mL，蘆丁對(duì)照品貯備液0.20、0.60、1.00、2.00、4.00、6.00 mL，木蝴蝶苷B對(duì)照品貯備液0.10、0.30、0.50、1.00、2.00、3.00 mL，芍藥苷對(duì)照品貯備液0.20、0.60、1.00、2.00、4.00、6.00 mL，肉桂酸對(duì)照品貯備液0.05、0.15、0.25、0.50、1.00、1.50 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成單一對(duì)照品的系列線性溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以各待測(cè)成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明各待測(cè)成分在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好，詳見(jiàn)表2。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，芍藥苷、蘆丁、木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸峰面積的RSD分別為0.68%、0.84%、0.23%、1.62%、0.86%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取自制咽炎片標(biāo)準(zhǔn)樣品（編號(hào)：S1）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行操作6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算各待測(cè)成分的含量。結(jié)果，芍藥苷、蘆丁、木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸含量的RSD分別為1.21%、0.56%、0.39%、1.01%、0.98%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S1）適量，于室溫下密封放置0、8、16、24、48 h時(shí)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，芍藥苷、蘆丁、木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸峰面積的RSD分別為1.13%、1.27%、1.36%、0.82%、1.07%（n=5），表明供試品溶液在上述條件下放置48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的自制咽炎片標(biāo)準(zhǔn)樣品（編號(hào)：S1，含芍藥苷0.113 2 mg/g、蘆丁0.205 1 mg/g、木蝴蝶苷B 0.358 7 mg/g、黃芩苷0.092 4 mg/g、肉桂酸0.141 0 mg/g）細(xì)粉2.0 g，精密稱定，混勻，置于具塞錐形瓶中，平行操作6份。各份樣品均分別加入“2.2.1”項(xiàng)下各單一對(duì)照品貯備液（芍藥苷貯備液1.00 mL、蘆丁貯備液4.00 mL、木蝴蝶苷B貯備液 3.00 mL、黃芩苷貯備液1.00 mL、肉桂酸貯備液2.00 mL），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算各待測(cè)成分含量并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，各待測(cè)成分平均加樣回收率為97.20%～98.07%（RSD為0.76%～2.03%，n=6），表明方法準(zhǔn)確度良好，詳見(jiàn)表3。

2.9 相對(duì)校正因子的計(jì)算及驗(yàn)證

2.9.1 相對(duì)校正因子的計(jì)算 以芍藥苷為內(nèi)參物，取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣不同體積進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算相對(duì)校正因子（fk/s），并取其平均值用于QAMS法定量分析。相對(duì)校正因子計(jì)算公式：fk/s=（Ws×Ak）/（Wk×As），式中Ws為內(nèi)參物進(jìn)樣量，As為內(nèi)參物峰面積，Wk為成分k的進(jìn)樣量，Ak為成分k的峰面積。內(nèi)參物芍藥苷（a）的含量采用外標(biāo)法計(jì)算，其他4種成分即蘆?。╞）、木蝴蝶苷B（c）、黃芩苷（d）、肉桂酸（e）的含量則采用各自與內(nèi)參物的fk/s進(jìn)行計(jì)算。各待測(cè)成分相對(duì)校正因子計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表4（注：內(nèi)參物芍藥苷的相對(duì)校正因子略去）。

2.9.2 相對(duì)校正因子的重現(xiàn)性考察 在一定范圍內(nèi)改變流動(dòng)相比例、流速、柱溫，考察分析條件的變化對(duì)相對(duì)校正因子的影響。結(jié)果顯示，流動(dòng)相比例、流速和柱溫在±5%范圍內(nèi)變化時(shí)各待測(cè)成分的相對(duì)校正因子的RSD均小于5%，表明其對(duì)各待測(cè)成分相對(duì)校正因子的影響較小。同時(shí)，分別采用不同品牌的色譜系統(tǒng)（Agilent 1260、Agilent 1200、Shimadzu LC-2030）和色譜柱[Hypersil GOLD-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）]，考察其對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果各待測(cè)成分的相對(duì)校正因子的RSD均小于5%，表明在不同色譜系統(tǒng)和色譜柱條件下各待測(cè)成分相對(duì)校正因子具有良好的重現(xiàn)性，詳見(jiàn)表5（注：內(nèi)參物芍藥苷的相對(duì)校正因子略去）。

2.9.3 待測(cè)成分色譜峰定位 色譜峰的準(zhǔn)確定位一般采用相對(duì)保留時(shí)間，同時(shí)結(jié)合色譜圖整體特征和特征峰的紫外吸收來(lái)定位待測(cè)成分色譜峰[6]。本研究以芍藥苷為內(nèi)參物，參照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，在不同色譜系統(tǒng)和不同色譜柱條件下考察其余各待測(cè)成分的相對(duì)保留時(shí)間的重現(xiàn)性。結(jié)果顯示，蘆丁、木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸與內(nèi)參物芍藥苷的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于5%。這表明在不同色譜系統(tǒng)和不同色譜柱條件下各待測(cè)成分的相對(duì)保留時(shí)間重現(xiàn)性良好，詳見(jiàn)表6（注：內(nèi)參物芍藥苷的相對(duì)保留時(shí)間略去）。

2.10 QAMS法測(cè)定咽炎片中5種指標(biāo)性成分含量及其與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果的比較

分別采用外標(biāo)法測(cè)定10批咽炎片中芍藥苷、蘆丁、木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸的含量;同時(shí)，以芍藥苷為內(nèi)參物，采用QAMS法對(duì)其他4種成分進(jìn)行定量分析。以相對(duì)誤差[RE，計(jì)算公式：RE=（QAMS法測(cè)得含量-外標(biāo)法測(cè)得含量）/外標(biāo)法測(cè)得含量×100%]對(duì)兩種方法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，兩種方法測(cè)得含量的RE絕對(duì)值均小于1%，表明其測(cè)定結(jié)果一致，詳見(jiàn)表7（注：內(nèi)參物芍藥苷的兩種方法測(cè)定結(jié)果數(shù)據(jù)相同）。

3 討論

本研究前期考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸水溶液等流動(dòng)相系統(tǒng)的分離效果，結(jié)果表明甲醇-0.35%磷酸水溶液對(duì)5種待測(cè)成分的分離效果最佳、分析時(shí)間也較短，故確定甲醇-0.35%磷酸水溶液為流動(dòng)相。此外，分別對(duì)5種待測(cè)成分在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的紫外吸收情況進(jìn)行考察，結(jié)果顯示芍藥苷在230 nm波長(zhǎng)處有吸收峰，木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸在280 nm波長(zhǎng)處有吸收峰，蘆丁在258、354 nm波長(zhǎng)處均有吸收且在280 nm波長(zhǎng)處有較強(qiáng)吸收，綜合考慮后，選擇230 nm作為芍藥苷的檢測(cè)波長(zhǎng)，280 nm作為其余4種成分的檢測(cè)波長(zhǎng)。在本研究色譜條件下，咽炎片中5種指標(biāo)性成分的出峰順序分別為芍藥苷、蘆丁、木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)內(nèi)參物選擇的要求[6]，芍藥苷出峰附近干擾成分少、出峰時(shí)間快、廉價(jià)易得，故選擇其作為內(nèi)參物。

中藥制劑組成復(fù)雜、作用機(jī)制不易明確的特性使其質(zhì)量控制存在諸多困難，通過(guò)單一指標(biāo)性成分難以全面評(píng)價(jià)藥品整體質(zhì)量[15]，因此多指標(biāo)測(cè)定有利于更好地反映中藥制劑的質(zhì)量水平。但采用常規(guī)的外標(biāo)法或者內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行多指標(biāo)測(cè)定時(shí)，存在對(duì)照品難以全部獲取或價(jià)格昂貴、操作較繁瑣，檢驗(yàn)時(shí)間更長(zhǎng)、成本高昂等問(wèn)題。而QAMS法可根據(jù)中藥制劑中各成分間的相應(yīng)比例，通過(guò)僅測(cè)定一個(gè)成分的含量，從而實(shí)現(xiàn)多個(gè)成分同步測(cè)定，克服了常規(guī)方法的弊端。本研究建立了同時(shí)測(cè)定咽炎片中5種指標(biāo)性成分的QAMS法，并將其測(cè)定結(jié)果與常規(guī)外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，QAMS法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果一致，RE絕對(duì)值均小于1%，且在不同測(cè)定條件下各待測(cè)成分相對(duì)校正因子和相對(duì)保留時(shí)間的重現(xiàn)性均良好。

綜上所述，本研究所建方法準(zhǔn)確、快捷、高效、價(jià)廉，可用于同時(shí)測(cè)定咽炎片中5種指標(biāo)性成分的含量，并可推廣用于其他中藥制劑的多指標(biāo)成分的同時(shí)測(cè)定。

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（收稿日期：2019-02-11 修回日期：2019-06-28）

（編輯：段思怡）