劉潔 胡晶 戴娜 徐冰雁 羅晶婧 胡梅 何迎春

[摘要]目的研究比較益氣解毒方4種主要三萜類化合物齊墩果酸、熊果酸、茯苓酸、黃芪甲苷抑制鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖的效應(yīng)。方法實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞功能分析技術(shù)（rcal-time uolabelcd cell function analysis teehnique，RTCA）動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)不同濃度的4種益氣解毒方三萜類化合物對(duì)體外培養(yǎng)的人鼻咽癌CNE2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，高通量細(xì)胞成像多功能檢測(cè)系統(tǒng)Cytation5（C5）監(jiān)測(cè)不同化合物對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞形態(tài)的影響，Western Blot法檢測(cè)不同化合物對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果RTCA結(jié)果顯示齊墩果酸、熊果酸、茯苓酸、黃芪甲苷均能夠不同程度地抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖，呈劑量依賴性，不同單體發(fā)揮最佳藥效的時(shí)間不同。茯苓酸和黃芪甲苷起效較快，茯苓酸在處理后24h達(dá)到最佳藥效，IC₅₀值為7.51umoI/L，黃芪甲苷持續(xù)作用36h，抑制效果達(dá)到最佳，熊果酸在刺激28h后IC₅₀值最低，為0.70umol/L，齊墩果酸后期作用效果較好，且所需濃度低。C5結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，4種三萜類化合物在作用36h后，CNE2細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)均發(fā)生明顯變化。western Blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，齊墩果酸、熊果酸、茯苓酸、黃芪甲苷能明顯抑制CNE2細(xì)胞中增殖相關(guān)蛋白Survivin、XIAP、PCNA的表達(dá)。結(jié)論益氣解毒方主要三萜類化合物均能抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖，降低增殖相關(guān)蛋白Survivin、XIAP、PCNA的表達(dá)水平，但藥物的作用時(shí)間和濃度均有差異。

[關(guān)鍵詞]益氣解毒方;三萜類化合物;鼻咽癌;細(xì)胞增殖

[中圖分類號(hào)]R285.5：R739.6[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.11.005

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是一種易發(fā)生于鼻咽黏膜上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，其惡性程度高，易復(fù)發(fā)且具有早期轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，中國(guó)鼻咽癌發(fā)病率和死亡率均高于世界平均水平（1.2/10萬(wàn)，0.7/10萬(wàn)），且男性高于女性，其具體發(fā)病機(jī)制尚未明確，可能與EB病毒感染和11g、14g、3p和9p的雜合性缺失的遺傳易感性以及現(xiàn)代環(huán)境中化學(xué)致癌因素、促癌因素等多種因素有關(guān)。益氣解毒方是本課題組研究和應(yīng)用20多年的一個(gè)經(jīng)驗(yàn)方藥，該方主要由黃芪、黨參、天花粉、黃連、茯苓、射干、白花蛇舌草、甘草組成，多年研究證明益氣解毒方對(duì)NPC細(xì)胞有很強(qiáng)的抑制和殺滅作用。益氣解毒方中三萜類化合物主要有齊墩果酸（oleanolic acid，OA）、熊果酸（ursolic acid，UA）、茯苓酸（pachymic acid，PA）、黃芪甲苷（astragaloside iv，ASI）等，其在多種腫瘤的防治過(guò)程中均具有一定作用，茯苓酸通過(guò)線粒體途徑能夠抑制胃癌細(xì)胞的致癌性，在鼻咽癌治療方面也有報(bào)道，另外，黃芪甲苷能通過(guò)多種途徑抑制胃癌和肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，熊果酸是一種用于乳腺癌治療的潛在抗癌化合物，齊墩果酸在癌癥預(yù)防和治療中的應(yīng)用中能改變多種細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑，但在抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖效應(yīng)方面尚未明確，本課題主要研究比較益氣解毒方主要三萜類化合物茯苓酸、齊墩果酸、熊果酸、黃芪甲苷對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖效應(yīng)的影響，明確益氣解毒方有效單體成分，為益氣解毒方的現(xiàn)代臨床應(yīng)用提供更為科學(xué)的理論依據(jù)。

實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞功能分析技術(shù)（real time cellu-lar analysis，RTCA）是一種基于電阻抗檢測(cè)的現(xiàn)代儀器，相似的小分子化合物會(huì)產(chǎn)生相似的細(xì)胞效應(yīng)特征曲線，因此，RTCA能夠?qū)崟r(shí)、不需標(biāo)記、持續(xù)動(dòng)態(tài)地檢測(cè)小分子化合物引起的細(xì)胞效應(yīng)。目前，RTCA廣泛應(yīng)用于國(guó)內(nèi)外的各項(xiàng)研究中，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RTCA比較益氣解毒方主要三萜類化合物抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖的效應(yīng)，然后運(yùn)用高通量細(xì)胞成像多功能檢測(cè)系統(tǒng)Cytation5（C5）監(jiān)測(cè)不同化合物對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞形態(tài)的影響，再通過(guò)Western Blot技術(shù)檢測(cè)不同化合物對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞相關(guān)增殖蛋白表達(dá)的影響，從微觀和分子方面為闡明益氣解毒方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供更豐富的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1細(xì)胞株

人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2.購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù)，由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物

RPMI-1640培養(yǎng)基和PBS緩沖液購(gòu)自Hyclone公司，胎牛血清購(gòu)自Gibco公司，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液和青霉素-鏈霉素混合液購(gòu)自北京Solarbio公司，二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自Amresco公司，茯苓酸、齊墩果酸、熊果酸、黃芪甲苷購(gòu)自上海金穗生物科技有限公司。

1.3試劑及儀器

雙人單面凈化工作臺(tái)（SW-CJ-2FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司）、CO₂培養(yǎng)箱（賽默飛世爾公司）、實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀RTCA（艾森生物科技公司）、高通量細(xì)胞成像多功能檢測(cè)系統(tǒng)Cytation5（美國(guó)伯騰儀器有限公司）、倒置顯微鏡（Olympus公司）、OdYssey CLX熒光掃描成像系統(tǒng)（Gene有限公司）。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng)及藥物溶解 將CNE2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO₂、濕度飽和的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培育，適時(shí)換液，細(xì)胞生長(zhǎng)至70%-80%傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

益氣解毒方4種三萜類化合物均用DMSO溶解后分裝，于-20℃保存，使用時(shí)全培稀釋，終濃度DMSO均為0.1%：對(duì)照組為含0.1%DMSO的全培。

1.4.2RTCA監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖情況 先將RTCA專用細(xì)胞增殖檢測(cè)培養(yǎng)板中加入50uL/孔的培養(yǎng)基平衡儀器，約15min后，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期鼻咽癌CNE2細(xì)胞，胰酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，5000個(gè)/孔接種于RTCA專用細(xì)胞增殖檢測(cè)培養(yǎng)板，每孔加入150uL細(xì)胞懸液，24h內(nèi)當(dāng)細(xì)胞貼壁進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即細(xì)胞指數(shù)（CI）達(dá)到1時(shí)，加入200uL不同濃度的化合物，同時(shí)設(shè)置溶劑對(duì)照組（DMSO組），每個(gè)組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于37℃，5%CO₂培養(yǎng)，RTCA實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)72h以上。以細(xì)胞指數(shù)（cell index，CI）反映細(xì)胞增殖情況。

CI=（Rn-Rb）/15

其中Rn表示孔接種有細(xì)胞時(shí)的電極阻抗值，Rb表示孔中只有培養(yǎng)基時(shí)的背景阻抗值。根據(jù)曲線分析益氣解毒方4種三萜類化合物的藥效隨濃度及時(shí)間變化的特征，并計(jì)算出合適時(shí)間點(diǎn)的半數(shù)抑制率（50%inhibiting concentration，IC₅₀的濃度。

1.4.3高通量細(xì)胞成像多功能檢測(cè)系統(tǒng)Cytation5（C5）監(jiān)測(cè)細(xì)胞形態(tài)變化待鼻咽癌CNE2細(xì)胞生長(zhǎng)至70%-80%，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，5000個(gè)/孔接種于96孔板，待細(xì)胞完全貼壁后，加不同三萜類化合物刺激，通過(guò)C5監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)，設(shè)定6h拍攝1次細(xì)胞形態(tài)圖像。

1.4.4Western Blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的表達(dá) 根據(jù)RTCA和C5結(jié)果確定藥物處理濃度和時(shí)間，待CNE2細(xì)胞生長(zhǎng)至70%-80%，加不同三萜類化合物，同時(shí)設(shè)置溶劑對(duì)照組（DMSO組），處理一定時(shí)間后提取細(xì)胞蛋白，測(cè)定蛋白濃度后，通過(guò)Western Blot檢測(cè)細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Survivin、XI-AP、PCNA的表達(dá)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用“x±s”表示，多組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，多重比較，方差齊性用LSD檢驗(yàn)，方差不齊用Dunnet′s T3檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1RTCA動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)益氣解毒方主要三萜類化合物對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖的影響

2.1.1不同三萜類化合物對(duì)CNE2細(xì)胞增殖的影響 為比較益氣解毒方4種三萜類化合物齊墩果酸、熊果酸、茯苓酸、黃芪甲苷對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖的抑制作用，分別將其設(shè)為不同濃度，采用RTCA動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)細(xì)胞活性，結(jié)果顯示4種化合物對(duì)于鼻咽癌細(xì)胞的增殖具有不同程度的抑制作用，且呈一定的劑量依賴性。見(jiàn)圖1-4。

2.1.2不同化合物的IC₅₀根據(jù)RTCA生長(zhǎng)曲線，計(jì)算出益氣解毒方不同單體在不同時(shí)間點(diǎn)的IC₅₀，結(jié)果顯示，益氣解毒方中不同三萜類單體在不同時(shí)間的IC₅₀有明顯差別，不同單體的起效時(shí)間、濃度和最佳藥效時(shí)間也不同。茯苓酸和黃芪甲苷見(jiàn)效快，加藥刺激12h后開(kāi)始顯效，茯苓酸在處理后24h達(dá)到最佳藥效，IC₅₀為7.51umol/L，之后，茯苓酸抑制鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖的作用逐漸降低，而黃芪甲苷依然發(fā)揮著較好的抑制作用，持續(xù)作用36h，抑制效果達(dá)到最佳，此時(shí)IC₅₀為5.44umol/L。熊果酸作用20h之前，對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖具有一定的抑制作用，但多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異較大，可能與細(xì)胞狀態(tài)及熊果酸起效時(shí)間有關(guān)，而熊果酸在刺激28h后達(dá)到最佳抑制效果，此時(shí)IC₅₀值最低，為0.70umol/L。齊墩果酸起效較慢，抑制CNE2細(xì)胞增殖的最佳作用時(shí)間為36h，h，IC₅₀值為15.25nmol/L，之后一段時(shí)間依然維持著較平穩(wěn)的作用趨勢(shì)。見(jiàn)表1-2。

2.2C5動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)益氣解毒方主要三萜類化合物對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞形態(tài)的影響

根據(jù)RTCA結(jié)果，4種化合物均選擇接近最佳藥效時(shí)間點(diǎn)的IC₅₀濃度作用于鼻咽癌CNE2細(xì)胞，通過(guò)C5動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)不同組的細(xì)胞形態(tài)圖像，結(jié)合RT-CA結(jié)果，我們選擇加藥處理0、24、36、48h4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞形態(tài)圖像，結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞正常生長(zhǎng)，形態(tài)飽滿均勻，于48h左右基本長(zhǎng)滿，齊墩果酸和熊果酸作用于藥物24h后，細(xì)胞大量死亡，漂浮，形成細(xì)胞碎片：茯苓酸和黃芪甲苷明顯抑制細(xì)胞增殖，部分細(xì)胞脫壁漂浮，細(xì)胞膜溶解，輪廓不清。見(jiàn)圖5。

2.3Western Blot檢測(cè)益氣解毒方主要三萜類化合物對(duì)CNE2細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的影響

根據(jù)RTCA和C5結(jié)果，4種化合物在作用36h后均有明顯的效應(yīng)，因此，在4種化合物處理細(xì)胞36h后提取總蛋白，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，增殖相關(guān)蛋白XIAP、PCNA、Survivin的表達(dá)水平均下降，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。見(jiàn)圖6。

3討論

目前，臨床上對(duì)于癌癥的治療主要以化療和放療為主，但其毒副作用嚴(yán)重，療效不穩(wěn)定，隨著中藥研究與開(kāi)發(fā)的深入，其抗腫瘤作用及優(yōu)勢(shì)愈發(fā)明顯，中藥成分復(fù)雜，不同成分能夠多途徑、多靶點(diǎn)、多效應(yīng)的作用于腫瘤細(xì)胞，研究認(rèn)為，中藥的抗腫瘤作用可能通過(guò)以下幾個(gè)途徑：預(yù)防致癌，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老、自噬、凋亡和分化，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)移和血管生成，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，聯(lián)合放化療減毒增效。但是，腫瘤的生長(zhǎng)復(fù)雜，是一個(gè)多階段的過(guò)程，因此，中藥防治腫瘤的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

鼻咽癌是耳鼻咽喉惡性腫瘤的主要癌種之一，益氣解毒方是本課題組長(zhǎng)期研究和應(yīng)用的經(jīng)驗(yàn)方，由黃芪、黃連、黨參、天花粉、白花蛇舌草、茯苓、甘草等中藥組成，具有益氣解毒、生津潤(rùn)燥之效，全方補(bǔ)瀉并用，氣陰雙補(bǔ)，扶正祛邪，幫助改善患者氣虛體質(zhì)，同時(shí)解毒養(yǎng)陰，起到平和抗癌的作用。有研究證明益氣解毒方能夠誘導(dǎo)大鼠鼻咽上皮細(xì)胞凋亡、抑制其增殖，從而有效逆轉(zhuǎn)細(xì)胞癌變進(jìn)程。益氣解毒方20多年以來(lái)抗鼻咽癌療效顯著，但是，其具體中藥成分在抗鼻咽癌過(guò)程中發(fā)揮的作用并不十分明確，從微觀角度分析其具體成分的作用，對(duì)益氣解毒方的進(jìn)一步優(yōu)化和臨床廣泛應(yīng)用具有重大意義。益氣解毒方中化合物成分較多，茯苓酸、槲皮素、黃芪甲苷、異歐前胡素、綠原酸、熊果酸、阿魏酸、齊墩果酸、漢黃芩素、芒柄花黃素、小檗堿等均是益氣解毒方中含有的化合物，其中多數(shù)化合物的抗腫瘤作用在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中已有報(bào)道。根據(jù)其分類，以三萜類化合物和苯丙素類化合物為主。本研究主要比較益氣解毒方君藥黃芪中齊墩果酸、熊果酸、黃芪甲苷以及藥茯苓中三萜類化合物茯苓酸對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)的影響，黃芪與茯苓相須為用，扶助正氣，而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這4種活性成分單獨(dú)作用于體外培養(yǎng)的人鼻咽癌CNE2細(xì)胞都具有一定的抑制作用，且能夠影響細(xì)胞形態(tài)，呈一定的劑量依賴性，其中不同化合物起效時(shí)間、濃度和最佳藥效時(shí)間不同。本研究發(fā)現(xiàn)茯苓酸和黃芪甲苷能夠快速作用于鼻咽癌細(xì)胞，發(fā)揮抗增殖作用：齊墩果酸和熊果酸較低濃度即能發(fā)揮較好的抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖的效應(yīng)，但相對(duì)來(lái)說(shuō)，作用時(shí)間較晚，這可能與其作用機(jī)制有關(guān)。另外，本研究采用的RTCA技術(shù)通過(guò)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)藥物處理后的細(xì)胞生長(zhǎng)，能夠預(yù)測(cè)藥物所帶來(lái)的靶向藥效和毒性，還能根據(jù)曲線圖判定藥物的最佳藥效時(shí)間，彌補(bǔ)了MTT和CCK8需不同時(shí)間點(diǎn)多次測(cè)定的不足，縮短了抗腫瘤藥物篩選和開(kāi)發(fā)的時(shí)間，同時(shí)也能為新藥開(kāi)發(fā)提供新的思路。

抗凋亡蛋白XIAP和Survivin與腫瘤凋亡密切相關(guān)，亦可介導(dǎo)細(xì)胞增殖，增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）是判斷細(xì)胞增殖狀態(tài)的重要指標(biāo)，研究發(fā)現(xiàn)其在鼻咽癌細(xì)胞中異常高表達(dá)，造成鼻咽癌細(xì)胞異常增殖，本實(shí)驗(yàn)中4種三萜類化合物均能下調(diào)XlAP，Suwivin、PCNA的表達(dá)水平。綜上所述，益氣解毒方主要三萜類化合物均能抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖，且與藥物的作用時(shí)間和濃度相關(guān)，其作用機(jī)制可能均與降低增殖相關(guān)蛋白Survivin、XIAP、PCNA的表達(dá)水平有關(guān)。