談為忠 陳志
摘要:奶牛乳腺炎是一種非常復(fù)雜的疾病。研究表明,miRNA(微小核糖核酸)通過(guò)靶向靶基因影響乳腺炎,單miRNA-mRNA聯(lián)合分析未能完全解釋金黃色葡萄球菌對(duì)乳腺炎的影響。本研究成功建立了中國(guó)荷斯坦奶牛金黃色葡萄球菌乳腺外源性感染的乳腺炎模型。從感染金黃色葡萄球菌的健康乳腺組織中提取總RNA,應(yīng)用Affymentrix技術(shù)對(duì)乳腺炎基因的差異表達(dá)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示:共有1230個(gè)不同表達(dá)的mRNA。一部分受影響的基因通過(guò)Q-PCR進(jìn)行了驗(yàn)證。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行通路分析。采用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)和分析差異表達(dá)miRNA與mRNA之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示:共有329對(duì)負(fù)相關(guān)miRNA/mPNA,其中31對(duì)mRNA上調(diào),298對(duì)mRNA下調(diào)。通過(guò)westemBlot和熒光素酶報(bào)告基因分析,評(píng)價(jià)miR-15a和白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)的激酶樣2(IRAK2)的差異表達(dá)。miR-15a和miR-15a靶基因(IRAK2)構(gòu)成一個(gè)潛在的miRNA-mRNA調(diào)控對(duì),可以作為預(yù)測(cè)乳腺炎反應(yīng)的生物標(biāo)志物。
關(guān)鍵詞:乳腺炎;金黃色葡萄球菌;miP,-15a;IRAK2
乳腺炎是奶牛經(jīng)常發(fā)生的一種疾病,該病可對(duì)奶牛健康造成嚴(yán)重危害,降低奶牛產(chǎn)奶質(zhì)量。金黃色葡萄球菌(S.aureus)是引起奶牛乳腺炎的主要病原體之一。金黃色葡萄球菌不是乳腺專(zhuān)性寄生菌,但它可以定值于乳頭、乳房、扁桃體、陰道以及軀體其他損傷部位的皮膚上,金黃色葡萄球菌在牛群中一旦傳播便很難根除,主要引起慢性感染且易對(duì)常見(jiàn)的抗生素產(chǎn)生耐藥性。其傳播方式可分為平行傳播和垂直傳播,當(dāng)擠奶程序不當(dāng),擠奶設(shè)備不良,乳頭有損傷時(shí)金黃色葡萄球菌就會(huì)入侵乳腺組織,經(jīng)擠奶工的手或擠奶設(shè)備進(jìn)行平行傳播;還可以通過(guò)給犢牛飼喂含病牛乳腺炎的乳汁進(jìn)行垂直傳播。蚊蟲(chóng)叮咬刺激乳頭等也可引起產(chǎn)犢母牛感染金黃色葡萄球菌,同時(shí),蚊蠅叮咬和環(huán)境不衛(wèi)生等因素可促進(jìn)金黃色葡萄球菌性乳腺炎的大量發(fā)生,并降低奶牛的產(chǎn)奶量。
金黃色葡萄球菌附著在宿主細(xì)胞和組織上,能夠逃避宿主的免疫反應(yīng),釋放破壞組織結(jié)構(gòu)的毒素。金黃色葡萄球菌對(duì)多種抗生素敏感,但也能獲得耐藥性。因此,金黃色葡萄球菌的研究對(duì)奶牛乳腺炎的致病性具有重要意義。盡管近幾十年來(lái)對(duì)金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎的作用機(jī)制進(jìn)行了大量的研究,但最近的研究主要集中在單基因分析或基因功能的驗(yàn)證上。因此,缺乏利用多組學(xué)分析和分子調(diào)控的綜合研究。基因芯片技術(shù)能允許同時(shí)分析成千上萬(wàn)個(gè)基因在特定組織或細(xì)胞中的表達(dá)模式,從而為細(xì)胞機(jī)制研究提供更廣闊的前景。本研究以金黃色葡萄球菌乳腺炎為研究對(duì)象,采用Affymetrix牛基因組表達(dá)微陣列技術(shù),對(duì)其基因表達(dá)譜進(jìn)行研究。隨后,構(gòu)建了miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖,為今后奶牛乳腺炎的耐藥性研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
一、材料和方法
(一)菌株的選擇
選用揚(yáng)州大學(xué)奶牛場(chǎng)的3頭健康中國(guó)荷斯坦奶牛作為研究對(duì)象。單個(gè)金黃色葡萄球菌菌落(編號(hào):ATCC29213),來(lái)自揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院在實(shí)驗(yàn)前生長(zhǎng)至1x107 CFU/mL金黃色葡萄球菌密度。每頭奶牛都選擇了相同的兩個(gè)產(chǎn)奶區(qū)域作為測(cè)試對(duì)象22/5000。實(shí)驗(yàn)組1例金黃色葡萄球菌,對(duì)照組1例PBS。將上述懸浮液或磷酸鹽緩沖鹽水5mL,用針管注入奶牛乳頭管。
(二)實(shí)驗(yàn)性乳腺炎病理檢查
乳腺組織脫蠟。洗滌15min后HE染色。去除染色部分以確保二甲苯不干燥。凝固后觀察切片。
(三)RNA提取
組織提取總RNA和DNase(脫氧核糖核酸酶),按照制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行處理。合格的RNA樣本將用于后續(xù)研究。
(四)測(cè)序分析
采用Gene Spring 11.0軟件對(duì)質(zhì)量控制合格數(shù)據(jù)(MAS5.0)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。差異表達(dá)基因分別采用t檢驗(yàn)分析、通路分析和層次聚類(lèi)分析。目的是篩選和探索與金黃色葡萄球菌性乳腺炎相關(guān)基因及其生物學(xué)意義。
(五)RT-qPCR和Western blot(蛋白質(zhì)印跡法)分析
采用S-Poly(T)法測(cè)定成熟miR-NA表達(dá)水平。0.5ug高質(zhì)量總RNA用于cDNA反轉(zhuǎn),使用RT試劑盒,miR-NA的相對(duì)表達(dá)量采用2-△ACt計(jì)算。Western blot(蛋白質(zhì)印跡法):使用RIPA buffer裂解細(xì)胞。通過(guò)SDS-PAGE對(duì)蛋白進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。實(shí)驗(yàn)使用的抗體有:?jiǎn)慰寺】笽RAK2和單克隆B-catin(Proteintech Gronup,66009,中國(guó))。用化學(xué)發(fā)光ECL West-ern blot系統(tǒng)檢測(cè)信號(hào)(Pierce,USA)。
(六)細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
根據(jù)之前的研究,對(duì)牛乳腺上皮細(xì)胞(BMECs)進(jìn)行了培養(yǎng)和分離。根據(jù)制造商的說(shuō)明,使用Lipofectami-BeTM RNAiMAX(Invitrogen,美國(guó))將細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-15a模擬物(60nm)或抑制劑(60nm)(Invitmgen,美國(guó))。轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞。
(七)熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)
構(gòu)建一個(gè)包含miRNA靶向IRAK2基因的目標(biāo)位點(diǎn)的載體psi-CHECK-2,該載體由Not和Xho酶切后插入,隨后檢測(cè)熒光活性。所有的結(jié)構(gòu)均通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證。
(八)統(tǒng)計(jì)分析
采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用方差分析,以*p<0.05、**p<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
二、結(jié)果
(一)病理改變及組織學(xué)
奶牛乳腺感染金黃色葡萄球菌后,取健康組和金黃色葡萄球菌組乳腺組織切片并進(jìn)行HE染色。400倍鏡下觀察乳腺組織,發(fā)現(xiàn)對(duì)照組有一個(gè)完整的充滿(mǎn)牛奶的腺泡腔。腺泡腔間組織致密完整,乳管正常(見(jiàn)圖1A)。相反,對(duì)金黃色葡萄球菌感染的奶牛乳腺組織的檢查顯示,在腺泡腔內(nèi)積聚了大量的炎性粒細(xì)胞。腺泡壁較薄,甚至破裂或嚴(yán)重變形,泌乳管發(fā)生嚴(yán)重充血,提示臨床乳腺炎情況(見(jiàn)圖1B)。
(二)轉(zhuǎn)錄組分析
1、芯片雜交掃描:芯片雜交后得到的熒光強(qiáng)度圖像大致可以反映出芯片的雜交狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)熒光強(qiáng)度圖亮度高、密度大、均勻且清晰度好。實(shí)驗(yàn)證明,該方法達(dá)到了實(shí)驗(yàn)要求,雜交效果良好。
2、基因芯片數(shù)據(jù)處理:在生物可重復(fù)性的情況下,即火山圖可以直觀地顯示兩組樣本間差異表達(dá)的基因。這些映射在一個(gè)圖中顯示了兩個(gè)重要的度量(折線變化,p值),被用來(lái)表達(dá)基因明顯不同的金黃色葡萄球菌組和健康組(見(jiàn)圖2)。在這項(xiàng)研究中,共有1230個(gè)基因,超過(guò)2倍的倍數(shù),由763個(gè)基因調(diào)節(jié),537個(gè)基因表達(dá)下調(diào)(Fc>2,P<0.05)。
3、差異基因表達(dá)通路分析:本研究利用功能注釋工具對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行通路分析,共篩選出15條與免疫相關(guān)的重要通路,這些通路均來(lái)自差異顯著的基因。這些通路是良好的功能指標(biāo),可以進(jìn)一步研究(見(jiàn)圖3)。
差異表達(dá)基因的Q-PCR驗(yàn)證:從差異表達(dá)基因中篩選出8個(gè)基因進(jìn)行熒光定量PCR分析。結(jié)果表明,這些基因的差異表達(dá)顯著(P<0.05),且趨勢(shì)與chip結(jié)果一致(見(jiàn)圖4)。結(jié)果表明,基因芯片分析結(jié)果可信。
(三)miR-15a特異性靶向IRAK2
選擇miR-15a和IRAK2驗(yàn)證其調(diào)控關(guān)系。軟件Targetscan利用3’-UTR相互分配,識(shí)別潛在的調(diào)控miRNA。發(fā)現(xiàn)IRAK2在3’-UTR中有一個(gè)miR-15a結(jié)合位點(diǎn),因此,推測(cè)IRAK2可能是miR-15a的atarget基因(見(jiàn)圖5B)。結(jié)果顯示:miR-15a抑制上調(diào)了IRAK2的表達(dá),而過(guò)表達(dá)miR-15a的細(xì)胞則下調(diào)了IRAK2的表達(dá)(圖5A,圖5D)。為了證明miR-15a直接靶向IRAK2,課題組合成了一個(gè)包含miR-15a靶向位點(diǎn)IRAK2的3’-UTR片段。該片段被克隆到一個(gè)psi-CHECK2-載體中,構(gòu)建一個(gè)3’-UTR報(bào)告質(zhì)粒。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示,miR-15a過(guò)表達(dá)降低了野生型報(bào)告基因3’-UTR的相對(duì)熒光素酶活性。然而,突變報(bào)告基因的相對(duì)熒光素酶活性沒(méi)有顯著差異(見(jiàn)圖5C)。這些結(jié)果表明:miR-15a直接靶向IRAK2 mRNA位點(diǎn),并發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。
A:將miR-15a模擬物或抑制劑轉(zhuǎn)染CMECs 48h;采用RT-qPCR法定量IRAK2表達(dá)水平(n=6)?;疑珬l代表負(fù)控制;黑條表示miR-15a模擬物或抑制劑。B和C:miR-15a在IRAK2’-UTR中的靶位點(diǎn)以及熒光素酶(Luc)表達(dá)載體的構(gòu)建與IRAK2 3’-UTR融合。WT表示帶有WTIRAK2 3’-UTR(684~691)的Luc報(bào)告向量;MU表示IRAK2 3’-UTR中miR-15a位點(diǎn)突變的Luc報(bào)告載體。D:Western blot分析miR-5a模擬物和NC處理實(shí)驗(yàn)中IRAK2表達(dá)情況。western blot分析miR-15a模擬物和抑制劑對(duì)IRAK2蛋白表達(dá)的影響。轉(zhuǎn)染48h后,分別獲得總蛋白。
三、討論
動(dòng)物疾病模型的建立是人為的。這一過(guò)程使動(dòng)物在一定的致病因素作用下,破壞一定的組織、器官或整個(gè)身體,導(dǎo)致功能、代謝和形態(tài)結(jié)構(gòu)的一些變化,進(jìn)而引發(fā)各種疾病。本研究利用金黃色葡萄球菌感染奶牛,建立乳腺炎模型,為乳腺炎的免疫和病理反應(yīng)研究提供參考,為乳腺炎的臨床治療提供依據(jù)。奶牛乳腺炎的病因眾多,致病微生物感染是其發(fā)病的主要因素。金黃色葡萄球菌對(duì)抗生素有很強(qiáng)的耐藥性。為確保乳腺炎模型能夠成功構(gòu)建并符合統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn),課題組選取了3頭奶牛,均來(lái)自同一奶牛場(chǎng),在相同的飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下,年齡、胎次、體重相同,產(chǎn)奶量相近,身體狀況良好。此外,這些奶牛的SCC必須低于100 000/mL,并且在牛奶中培養(yǎng)的細(xì)菌呈陰性。通過(guò)對(duì)奶牛進(jìn)行的實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)1x10CFU/mL濃度的抑菌液5mL對(duì)細(xì)菌是有效的。
乳腺炎作為奶牛的常見(jiàn)病,對(duì)奶牛行業(yè)造成了嚴(yán)重的危害。為了更好地解決這一問(wèn)題,在分子水平上闡明乳腺炎免疫反應(yīng)的相關(guān)控制機(jī)制尤為重要。已知miRNA通過(guò)對(duì)特定靶基因的作用來(lái)協(xié)調(diào)疾病反應(yīng)的某些方面。事實(shí)上,一些miRNA在應(yīng)對(duì)細(xì)菌感染時(shí)的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。之前,Li R等人對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行了相關(guān)miRNA測(cè)序分析。LiR等人使用非配對(duì)測(cè)試完成了數(shù)據(jù)分析。將組樣本合并為2個(gè)生物復(fù)制體。此外,LiR等使用Audic_Claverie公式計(jì)算p值。以p值<0.05和TPM差異倍數(shù)>2為閾值,選擇差異表達(dá)miRNA。本文采用6個(gè)樣本,每組比較3個(gè)樣本。此外,本文根據(jù)樣本配對(duì)測(cè)試分析,使用DESeq2軟件的配對(duì)測(cè)試算法。該試驗(yàn)采用一對(duì)一配對(duì)進(jìn)行鑒別篩選。所選mima p值<0.05,TPM差異倍數(shù)為>2。樣本量不同,之前的分析為2個(gè)樣本,現(xiàn)在的分析為6個(gè)樣本。對(duì)于之前的研究,本組沒(méi)有重復(fù)計(jì)算,本研究是根據(jù)本組3次重復(fù)計(jì)算,樣本是成對(duì)的。金黃色葡萄球菌感染共導(dǎo)致1230個(gè)基因表達(dá)差異。其中763個(gè)基因上調(diào),537個(gè)基因下調(diào)。這些基因包含研究最多的乳腺炎抗性基因:白細(xì)胞介素和白細(xì)胞介素受體基因IL6、IL17A和CXCRl。IL-6是一種多功能炎癥細(xì)胞因子,是機(jī)體細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵成員。該細(xì)胞因子在炎癥反應(yīng)中起重要作用,是由212個(gè)氨基酸組成的糖蛋白。IL-6具有多種生物學(xué)功能,在淋巴細(xì)胞、炎癥和免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)中IL-6也明顯上調(diào),推測(cè)IL-6在金黃色葡萄球菌感染奶牛炎癥過(guò)程中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。CXCRl主要在中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中表達(dá),介導(dǎo)中性粒細(xì)胞的活化。該細(xì)胞因子促進(jìn)貯藏酶的釋放,增強(qiáng)吞噬作用,引起機(jī)體局部炎癥反應(yīng),從而起到殺滅致病菌的作用。在本研究中,感染金黃色葡萄球菌的奶牛體內(nèi)CXCRl的表達(dá)明顯高于對(duì)照組。本研究還證實(shí)了先前CXCRl與奶牛乳腺炎的相關(guān)性。CXCRl可能是奶牛抗乳腺炎的重要候選基因。
miRNAs及其靶基因的生物學(xué)分析可以為我們研究金黃色葡萄球菌感染乳腺組織引起的乳腺炎的免疫調(diào)節(jié)過(guò)程提供良好的方法。通過(guò)比較感染金黃色葡萄球菌和對(duì)照組織中miRNA和mRNA的表達(dá)譜,可以發(fā)現(xiàn)與奶牛乳腺炎發(fā)生相關(guān)的關(guān)鍵miRNA和mRNA。由此產(chǎn)生的miRNA/mRNA對(duì)參與了廣泛的生物學(xué)功能。IRAK2基因在金黃色葡萄球菌組中顯著上調(diào),屬于絲氨酸,蘇氨酸激酶家族的白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶(IRAKs)。其主要作用是在炎癥細(xì)胞因子白細(xì)胞介素一1(IL-1)上調(diào)時(shí)與白細(xì)胞介素受體(IL-IR)結(jié)合。IRAK2、IRAKM、IRAK-Ib、IRAKlc在IRAK家族中為T(mén)LR信號(hào)通路負(fù)調(diào)控。研究表明,IRAK2具有顯著的負(fù)調(diào)控功能,可以減少LPS誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞凋亡。同樣,miR-15a參與多種調(diào)節(jié)炎癥和免疫細(xì)胞分化的功能。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示:miR-15a顯著抑制熒光素酶活性,提示miR-15a對(duì)熒光素酶活性具有抑制作用。此外,通過(guò)改變miR-15a在3’UTR中的潛在結(jié)合位點(diǎn),可以消除miR-15a對(duì)IRAK2的3’UTR的抑制作用。綜上所述,課題組推測(cè)miR-15a可以靶向并抑制IRAK2。本研究獲得的miRNA-mRNA調(diào)控對(duì)金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的奶牛乳腺炎可能起到重要作用。因此,未來(lái)的研究可以為評(píng)估細(xì)菌感染引起的乳腺炎的免疫反應(yīng)和相關(guān)控制機(jī)制提供參考。這些信息對(duì)于制定治療奶牛乳腺炎的策略可能具有一定的價(jià)值。