李恒 周知恩 陳勇 陸承聰 張祥琴 王諒 陳藝欣 田厚軍 林碩 張潔 游泳 魏輝

摘要：【目的】西花薊馬Frankliniella occidentalis（Pergande）是一種重要的外來入侵害蟲，其繁殖能力強、寄主范圍廣、抗藥性強，給我國蔬菜、花卉等經(jīng)濟作物造成了嚴重危害。本研究旨在評估膜飼喂和顯微注射dsActin對西花薊馬Actin基因的沉默效率，以期為薊馬類等小型昆蟲基因功能的研究提供方法和依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^膜飼喂和顯微注射的方法將體外合成的dsActin導人西花薊馬二齡若蟲體內(nèi)，用RT-qPCR方法檢測Actin基因的mRNA表達;通過單頭飼養(yǎng)方法觀察統(tǒng)計西花薊馬成蟲體長、成蟲翅膀或胸腹部畸形率及死亡率。【結(jié)果】ds，4ctin膜飼喂后24、48、72h，Actin基因的相對表達量分別為對照組的97%、91%和98%;通過顯微注射將dsActin注入西花薊馬體腔，在注射后24、48、72h，Actin基因的表達量分別為對照組的68%、56%和53%。注射ds，4ctin的西花薊馬在第24～120h死亡率為44%～98%，顯著高于dsGFP對照組;此外，dshctin組個體體長僅為dsGFP對照組的90%，且翅膀或胸腹部出現(xiàn)畸形率為41%?！窘Y(jié)論】顯微注射dsActin能顯著沉默西花薊馬Actin基因mRNA水平的表達，并引起西花薊馬個體不正常發(fā)育和死亡，從而建立薊馬類小型昆蟲RNAi體系。

關(guān)鍵詞：西花薊馬;RNA干擾;膜飼喂法;顯微注射法

中圖分類號：S433.89

文獻標志碼：A 文章編號：1008-0384（2019）10-1179-06

0引言

【研究意義】RNA干擾（RANinterference，RNAi）技術(shù)廣泛應用于動物、植物和微生物等基因功能的研究。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在植物體表達dsRNA，當昆蟲取食帶有dsRNA的植物，dsRNA隨食物進入到昆蟲體內(nèi)，使昆蟲某些功能喪失造成損傷或者死亡，從而達到防治害蟲的效果。利用RNAi防治害蟲的設想已經(jīng)在鱗翅目和鞘翅目昆蟲上實現(xiàn)。西花薊馬Frankliniella occidentalis（Pergande）是一種危險的入侵害蟲，對蔬菜和觀賞性植物危害嚴重，并且其傳播的番茄斑萎病毒對寄主植物造成重大損失。西花薊馬蟲體小，隱蔽性強，目前常用的防治方法很難有效控制。因此，建立快速有效的西花薊馬RNA干擾技術(shù)，對研究西花薊馬的基因功能以及防治薊馬類害蟲有重要意義。【前人研究進展】目前將外源dsRNA導人昆蟲體內(nèi)的方式有很多，如飼喂法、注射法、浸泡法、轉(zhuǎn)基因植物表達后昆蟲取食等，但是飼喂法和注射法是最常用的兩種方法。對于有些昆蟲，采用飼喂和注射兩種方法都取得較好效果。如煙粉虱通過飼喂dsRNA和顯微注射偽蛹和成蟲都能有效抑制靶基因的表達;以Pxbursa部分序列的雙鏈RNA（dsRNA）飼喂小菜蛾4齡末期幼蟲，發(fā)現(xiàn)蛹期Pxbursa的表達受到了顯著抑制，小菜蛾的發(fā)育停滯在蛹期而無法正常羽化，并最終死亡;利用合成的VgR siRNA注射小菜蛾雌蛹，結(jié)果顯示16h內(nèi)VgR的表達受到明顯抑制，證明RNAi對小菜蛾有效。飼喂法也在桔小實蠅、柑橘全爪螨、褐飛虱、白背飛虱等昆蟲上成功應用，注射法在桔小實蠅、柞蠶、中華按蚊、豌豆長管蚜等昆蟲上行之有效。但對有些昆蟲飼喂法沒有效果，如喂食黑腹果蠅表達dsRNA的酵母沒有獲得成功;飼喂法也不能有效沉默東亞飛蝗V-ATPaseA/E、CHSl、Kr-hl和Verm基因的表達。應用RNAi抑制害蟲靶基因表達在害蟲防治中表現(xiàn)出巨大潛力，目前在刺吸式口器的同翅目昆蟲蚜蟲、葉蟬和粉虱防治上都已得到應用?！颈狙芯壳腥朦c】國內(nèi)外對西花薊馬RNAi的研究成熟經(jīng)驗很少，國內(nèi)沒有關(guān)于薊馬RNAi的研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究選用膜飼喂法和顯微注射法干擾西花薊馬的Actin基因，明確薊馬RNA干擾的合適方法，為小型昆蟲基因功能的研究和驗證提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試昆蟲

西花薊馬由云南省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所提供，用四季豆飼養(yǎng)于人工氣候箱（MGC-350HP-2，上海一恒科技有限公司）。飼養(yǎng)條件為溫度25℃，相對濕度60%～70%，光照L：D=14：10h。

1.2西花薊馬Actin基因的擴增驗證

根據(jù)NCBI西花薊馬Actin基因序列（GenBank登錄號：XM 026432071.1）設計Actin砌引物（表1）。西花薊馬總RNA的提取采用Trizol（Ambion公司）法，然后用EasyScript Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金生物科技有限公司）反轉(zhuǎn)成cDNA。再以西花薊馬cDNA為模板擴增Actin基因，PCR產(chǎn)物回收純化（TransGen Biotech，catalognumber：DP209）后連接到T載體上，挑選單菌落進行PCR鑒定，并送上海鉑尚生物技術(shù)有限公司測序。

1.3dsRNA的合成

根據(jù)已擴增驗證的西花薊馬Actin基因序列設計合成dsRNA引物，然后在引物的5’端加上T7啟動子序列（表1）。用HiScribe T7Quick High Yiel dRNASynthesis Kit（New England Biolabs，美國）先擴增5’端均含有T7啟動子序列的DNA片段，隨后以獲得的DNA片段為模板，用T7轉(zhuǎn)錄酶進行體外轉(zhuǎn)錄以合成目的基因的dsRNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測dsRNA的質(zhì)量、紫外分光光度計檢測濃度，合成的dsRNA置于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4dsRNA穩(wěn)定性的檢測

為了保證dsRNA在膜飼喂和注射過程中的完整性，先將dsRNA分別置于室溫12h和24h，然后通過凝膠電泳檢測dsRNA的降解情況。

1.5膜飼喂

首先將一塊小Parafilm拉伸至很薄覆蓋在直徑約30mm的飼喂裝置上，Parafilm膜的厚薄程度要保證薊馬可以刺破取食液體。在第一層膜上添加飼喂液體50ul（20%蜂蜜水：dsRNA=1：1，dsRNA質(zhì)量濃度為0.5ug·ul），再覆蓋上第二層膜以保護液體不揮發(fā)和不受污染，第二層膜上放上四季豆以吸引薊馬到膜附近取食。然后分別將100只蛻皮12h的二齡西花薊馬若蟲放置于膜飼喂裝置，每隔24h重新更換dsActin。同時對照組飼喂dsGFP。24、48和72h后各取20只活的西花薊馬檢測dsRNA的沉默效果。試驗重復3次。

1.6顯微注射

利用油壓式手動微量注射儀（CellTramoil，Eppen.dorf）將質(zhì)量濃度為0.5ug·ul的dsActin和dsGFP分別注射到200只蛻皮12h的2齡西花薊馬若蟲體腔。注射后24、48、72h分別取出20只活蟲檢測dsRNA的沉默效果。另外，在注射后12h，取30只活蟲，單頭飼養(yǎng)于放置四季豆的飼養(yǎng)管中，每天觀察存活情況和形態(tài)變化，共觀察5d，統(tǒng)計死亡率、體長和畸形率。同時，羽化后12h在體視鏡（型號DMSZ7）下測量體長。試驗重復3次。

1.7Real-time PCR檢測dsRNA沉默效率

Trizol法提取西花薊馬的總RNA，然后用EasyScript Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金生物科技有限公司）反轉(zhuǎn)錄為eDNA。以西花薊馬18S rRNA（GenBank登錄號：XM 026420069.1）作為內(nèi)參基因，分別設計RT-qPCR引物（表1）。參照GoTaq qPCR Master Mix（2x）試劑盒（Promega公司，美國）操作說明配制反應體系，每個樣品設3個重復，在BIO-RAD CFX96實時定量PCR儀（Bio-Rad，美國）檢測目標基因的表達量。獲得的CT值利用2計算目的基因的相對表達水平。

1.8數(shù)據(jù)分析

不同干擾時間dsRNA處理之間的多重比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA，Tukey HSD test）（SPSS 21.0），差異顯著性檢驗水平標準P<0.05。

2結(jié)果與分析

2.1西花薊馬Actin基因克隆驗證

根據(jù)NCBI上西花薊馬的Actin序列（GenBank登錄號：XM 026432071.1）設計引物，PCR擴增及測序結(jié)果表明，Actin基因完整的開放性閱讀框長度為1131bp，編碼376個氨基酸（圖1-2），與已經(jīng)報道的西花薊馬Actin基因序列一致。

2.2dsRNA穩(wěn)定性

瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果表明，dsRNA放置24h后仍然保持較好的完整性（圖3）。因此膜飼喂進入薊馬體內(nèi)的dsRNA是完整的。

2.3膜飼喂和顯微注射dsActin對西花薊馬Actin基因表達的影響

RT-qPCR檢測結(jié)果表明，與對照組飼喂dsGFP相比，膜飼喂dsActin24h、48h和72h后，Actin基因的相對表達量分別為對照組的97%、91%和98%，這表明通過膜飼喂dsActin對西花薊馬Actin基因表達抑制作用不顯著（圖4）。相反，通過顯微注射將ds-Actin注入西花薊馬體腔，在注射后24、48和72h，Actin基因的表達量分別為對照組的68%、56%和53%（圖5），與對照組均有顯著差異（P<0.05）。

2.4注射dsActin對西花薊馬存活率和形態(tài)的影響

由2.3可知，顯微注射質(zhì)量濃度為0.5ug.uL的dsActin可顯著抑制西花薊馬Actin基因的表達，觀察發(fā)現(xiàn)，注射dsGFP的西花薊馬在第24-120h后的死亡率為29%-52%，而注射dsActin基因的西花薊馬死亡率在第24-120h達44%-98%（圖5-A）;同時，注射dsActin的西花薊馬成蟲翅膀或胸腹部畸形率為41%（圖5-B-C），且個體體長只有注射dsGFP的對照組的90%左右（圖5-D）。說明注射dsActin成功干擾了西花薊馬的Actin基因，并對其生長發(fā)育產(chǎn)生了影響。

3討論與結(jié)論

RNA干擾是由雙鏈RNA介導、引起目的基因mRNA序列特異性降解的基因沉默的一個過程。通過RNAi沉默靶標基因是當前研究昆蟲基因功能的重要手段。飼喂法、注射法、浸泡法、直接取食轉(zhuǎn)基因植物等是將外源dsRNA導入昆蟲體內(nèi)的常用方式。已有研究表明，飼喂dsRNA的干擾效率明顯低于將其注射到昆蟲體腔，如在棉鈴蟲的RNAi試驗中，僅飼喂一次很難產(chǎn)生明顯的RNAi效應，連續(xù)飼喂才與注射一次的RNAi效果相。本研究通過比較膜飼喂和微針注射dsActin兩種方式沉默西花薊馬Actin基因，結(jié)果表明，微針注射方式成功實現(xiàn)了對目的基因的干擾;盡管通過增加膜飼喂次數(shù)來增加攝入昆蟲體內(nèi)dsRNA的量，但是72h后仍然不能有效沉默目的基因。因此，微針注射dsRNA是沉默西花薊馬目的基因的有效方式，該結(jié)果為后續(xù)西花薊馬及小型昆蟲基因功能的研究提供了技術(shù)手段。

基于注射法的RNA干擾方法能減小昆蟲表皮或者中腸障礙，使dsRNA快速進入體腔或者血淋巴，同時還能準確控制進入蟲體的dsRNA劑。本研究表明，顯微注射方式雖然具有干擾效果好的優(yōu)點，但是注射會對昆蟲造成直接的物理損傷，增加昆蟲死亡率。因此，在注射時要選擇合適的針頭、注射體積、注射位置，盡量避免損傷昆蟲。此外，顯微注射前較常用的麻醉方法有乙醚麻醉法、二氧化碳麻醉法和冰凍麻醉法等，選擇合適的麻醉方法能降低昆蟲死亡率。本研究發(fā)現(xiàn)在薊馬麻醉過程中，二氧化碳麻醉法具有速度快、損傷小的優(yōu)點。

綜上所述，顯微注射dsRNA是沉默薊馬目的基因的有效方式，適于開展薊馬類小型昆蟲基因功能分析，篩選防控靶標基因，同時在應用過程中，還需要綜合考慮各種因素，從而提高RNA干擾效果。