雷鳴，胡楠，王遠一飛，張燕

(1.天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，天津300457;2.南開大學醫(yī)學院天津市食品科學與健康重點實驗室，天津300071）

0 引言

鮮牛乳是理想的微生物生長基質(zhì)[1]，過高的儲存溫度，會導致其變質(zhì)。因此在其儲運環(huán)節(jié)中，低溫成為必要條件。低溫能夠抑制牛乳中大部分微生物的活性，但其中的嗜冷菌仍能在低溫環(huán)境中繁殖[2]。熱滅菌法可有效殺滅嗜冷菌，但其分泌的蛋白酶和脂肪酶具有耐熱性，可導致原料乳在熱滅菌后產(chǎn)生凝膠，沉淀，變苦[3]，并造成發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)缺陷[4]。目前我國食品安全國家標準中未規(guī)定生乳中嗜冷菌限量，因此分析低溫下嗜冷菌的變化規(guī)律對于提高牛乳品質(zhì)具有重要意義。

本研究通過16S rRNA高通量測序及國標方法，監(jiān)測原料乳在不同溫度儲存下嗜冷菌數(shù)及菌落總數(shù)的變化，旨在探究在不同溫度儲存期間牛乳衛(wèi)生指標的變化情況以及保證原料乳高品質(zhì)的冷藏溫度及時間。

1 實驗

材料為原料乳。

1.1 樣品測序

取在4℃儲存一天的原料乳兩份，每份樣品25 g，過0.22μm無菌濾膜，將原料乳中的微生物富集于膜上，然后將無菌濾膜放入無菌采樣袋于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.1 基因組DNA的提取和PCR擴增

采用SDS方法對樣本的基因組DNA進行提取，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度。取適量的樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。

以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物，New England Biolabs公司的Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進行PCR，確保擴增效率和準確性。引物對應區(qū)域為16SV4區(qū)引物（515F和806R）。

1.1.2 PCR產(chǎn)物的混樣和純化

PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測：根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用質(zhì)量分數(shù)為2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，用膠回收試劑盒回收目的條帶。

1.1.3 文庫構(gòu)建和上機測序

使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，使用HiSeq2500 PE250進行上機測序。

1.2 測序數(shù)據(jù)分析

1.2.1 測序數(shù)據(jù)處理

根據(jù)Barcode序列和PCR擴增引物序列從下機數(shù)據(jù)中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物列后應用文獻[5]中方法對每個樣品的序列進行拼接，得到原始數(shù)據(jù)；再經(jīng)過嚴格的過濾處理[6]得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)。

參照文獻[7]中的質(zhì)量控制流程，進行數(shù)據(jù)截取和長度過濾操作，經(jīng)過以上處理后得到的數(shù)據(jù)還需要通過文獻[8]中方法與數(shù)據(jù)庫進行比對檢測嵌合體序列，并最終去除其中的嵌合體序列[9]，得到最終的有效數(shù)據(jù)。

1.2.2 OTU聚類和物種注釋

利用Uparse軟件[10]對所有樣品的全部有效數(shù)據(jù)以97%的一致性進行聚類成為OTUs（Operational Taxonomic Units），同時選取OTUs的代表性序列進行物種注釋，用Mothur方法與SILVA[11]的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫[12]進行物種注釋分析（設(shè)定閾值為0.8～1），獲得分類學信息并統(tǒng)計各樣本的群落組成。使用MUSCLE[13]軟件進行快速多序列比對，得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。最后以樣品中數(shù)據(jù)量最少的為標準進行均一化處理，后續(xù)的Alpha多樣性分析都是基于均一化處理后的數(shù)據(jù)。

1.3 菌落總數(shù)測定

食品微生物學檢驗：乳與乳制品檢驗GB 4789.18-2010[14]。

1.4 嗜冷菌測定

乳與乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜熱需氧芽孢數(shù)的測定NY/T 1331-2007[15]。

1.5 原料乳儲存條件

取新鮮原乳，分別在4，10，15℃下儲存并在不同規(guī)定時間取樣，測定總菌數(shù)、酸度及嗜冷菌菌數(shù)并記錄其變化。不同儲存溫度下的監(jiān)測總時間及檢測頻率如表1所示。

表1 原料乳不同儲存溫度檢測頻率及檢測時間

2 結(jié)果與討論

2.1 原料乳中的細菌多樣性

將原料乳中提取的微生物核酸序列進行測序聚類，得到樣品聚類信息，結(jié)果如圖1所示。

圖1 樣品OTUs聚類韋恩圖

圖1 中，M 1和M 2分別代表測序樣品；65為兩個樣品共有的聚類單元數(shù)；12為M 1樣本的特有聚類單元數(shù)；7為M 2樣本的特有聚類單元數(shù)。兩個樣本共檢測到聚類單元（OTUs）84個，其中M 1樣品中檢測出77個聚類單元，M 2樣品中測得72個聚類單元。兩個樣品共有的聚類單元65個，超過聚類單元的70%，說明兩份原料乳樣品中檢出的微生物物種數(shù)量雖然有所不同，但大部分微生物相同。

一些微生物能夠在低溫儲存一天后成為原料乳中的優(yōu)勢菌種，在低溫環(huán)境中能夠保持一定繁殖和代謝能力，是影響原料乳品質(zhì)的關(guān)鍵微生物。通過聚類單元的物種注釋信息及各個物種的相對豐度信息，可以直觀找到原料乳樣品中的優(yōu)勢微生物。根據(jù)樣品中相對豐度前十的物種相對豐度信息繪制的物種分類樹如圖2所示。圖2中，左側(cè)為圖例，紅色扇形代表樣品M 1，藍色代表樣品M 2；扇形面積大小表示樣品在該分類上相對豐度的比例大小；分類名下方的兩個數(shù)字分別表示所有樣品在該分類上的平均相對豐度，前者表示占所有檢出序列的相對豐度，后者表示占樣品中細菌的相對豐度。

圖2 TOP10物種分類樹

分析可知，原料乳中的原核微生物主要分屬三個門，擬桿菌門和厚壁菌門的相對豐度占比超過90%，其中擬桿菌門所占比例最高，擬桿菌門中主要有兩個屬在原料乳樣品中相對豐度較高，分別為金黃桿菌屬和黃桿菌屬。樣品中變形菌門主要包括醋酸桿菌科的醋酸桿菌屬，腸桿菌科的摩根氏菌屬，莫拉菌科的不動桿菌屬和嗜冷桿菌屬以及假單胞菌科的假單胞菌屬。除此之外，樣品中還檢出了少量厚壁菌門的微生物，主要包括乳球菌屬和葡萄球菌屬。

在相對豐度前十的物種中，含量最為豐富的是黃桿菌屬，其相對豐度占所有檢出的細菌的47.66%，其次為假單胞菌屬，相對豐度為39.54%。兩個屬的微生物均為牛乳中常見的嗜冷菌[16]。不動桿菌屬和嗜冷桿菌屬也具有在低溫下繼續(xù)生長的能力，相對豐度分別為3.77%和0.55%。

通過對16SrRNA高通量測序結(jié)果分析可知，此次采集的原料乳中，嗜冷菌主要來自四個屬，分別為黃桿菌屬、假單胞菌屬、不動桿菌屬和嗜冷桿菌屬。假單胞菌屬是對原料乳危害最大的嗜冷菌之一[17]。假單胞菌及其分泌的耐熱蛋白酶也被當作嗜冷菌耐熱蛋白酶的模板，許多研究者對其進行了深入研究[18-20]。不動桿菌屬和黃桿菌屬除了能夠在低溫環(huán)境中繼續(xù)生長繁殖，其潛在致病性和耐藥性也受到廣泛關(guān)注[21-24]，對牛乳的影響不僅僅是對成品乳質(zhì)量的威脅，低溫環(huán)境下不動桿菌及黃桿菌在牛乳中的相對含量逐漸上升，若在加工設(shè)備中其毒素和分泌物不斷累積，除了可能對原料乳品質(zhì)產(chǎn)生不良影響，還可能引發(fā)食品安全問題。

2.2 不同儲存條件下原料乳中嗜冷菌及菌落總數(shù)的變化

原料乳從收集入廠到生產(chǎn)期間要求冷卻到4℃貯存，但冷鏈運輸及工廠儲存條件的變化會使原料乳很難嚴格維持在4℃，而原料乳低溫儲存過程中微生物變化情況將直接影響最終產(chǎn)品的質(zhì)量，因此儲存環(huán)節(jié)是牛乳品質(zhì)控制的關(guān)鍵。實驗模擬可能的溫度變化分別設(shè)置了4，10，15℃貯存原料乳；定時測定嗜冷菌及菌落總數(shù)。

原料乳在不同溫度儲存期間菌落總數(shù)變化如圖3所示。圖3（a）為4℃和10℃儲存時原料乳菌落總數(shù)變化；圖3（b）為15℃儲存時原料乳菌落總數(shù)變化。

原料乳中總菌落數(shù)在（1.5～1.8）×105mL-1之間，反映出原料乳衛(wèi)生狀況較好。分析發(fā)現(xiàn)，菌落總數(shù)的變化隨貯存溫度、貯存時間的變化有顯著差異。4℃貯存72 h后菌落總數(shù)仍在1×106mL-1內(nèi)；10℃貯存64 h后樣品中菌落總數(shù)快速增加，貯存72 h后超過國家安全標準2×106mL-1；15℃貯存24 h后菌落總數(shù)快速增加，超過國家規(guī)定的安全限量。

我國“生乳食品安全標準”中并沒有對嗜冷菌進行限量，但原料乳低溫儲存時嗜冷菌能分泌蛋白酶、脂肪酶等引起牛乳品質(zhì)劣變。因此嗜冷菌是影響液態(tài)奶品質(zhì)的重要因素。原料乳在不同溫度儲存期間的嗜冷菌數(shù)變化情況如圖4所示。

圖3 原料乳菌落總數(shù)變化

圖4 不同溫度儲存期間的嗜冷菌數(shù)變化情況

原料乳中嗜冷菌含量在1～1.3×105mL-1。不同貯存溫度下，嗜冷菌數(shù)變化差別較大。4℃貯存24 h，嗜冷菌數(shù)無明顯變化，貯存至32 h嗜冷菌數(shù)顯著增加，但后期貯存至72 h并沒有檢測到數(shù)量顯著增加；10℃貯存時，24 h時嗜冷菌數(shù)已增至1×106mL-1，72 h后超過國家規(guī)定的原乳中菌落總數(shù)限量值2×106mL-1；15℃貯存8 h時，嗜冷菌數(shù)已顯著增加，24 h后嗜冷菌數(shù)超過2×106mL-1。

以上結(jié)果說明，低溫儲藏過程中嗜冷菌依然可以存活并增殖，4-15℃貯存條件下，隨溫度的升高嗜冷菌的生長繁殖速度迅速增大。雖然在低溫下原料乳中微生物數(shù)量增長緩慢，但其多樣性能夠迅速發(fā)生變化[25-27]。冷藏前，嗜冷菌僅占原料乳微生物總量的10%左右[28]，16SrRNA高通量測序結(jié)果表明4℃冷藏一天后，原料乳中的嗜冷菌相對含量超過了90%，嗜冷菌成為了原料乳中的優(yōu)勢菌。盡管15℃貯存24 h后菌落總數(shù)才超過生乳安全限量標準（2×106CFU/mL），但低溫貯存過程中伴隨嗜冷菌的繁殖生長，嗜冷菌分泌蛋白酶、脂肪酶等的風險增大，極易引起牛乳品質(zhì)劣變。因此實際運輸和貯存期間應嚴格控制溫度，應盡可能以更低的溫度貯存生乳，以保證生乳的安全衛(wèi)生，提高乳制品品質(zhì)。

現(xiàn)行國標中雖然規(guī)定了嗜冷菌的計數(shù)方法，但其方法培養(yǎng)時間過長，無法滿足企業(yè)生產(chǎn)需要。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，低溫儲存時，原料乳中的嗜冷菌數(shù)量和菌落總數(shù)能夠呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系，且儲存溫度越低，菌落總數(shù)和嗜冷菌數(shù)的相關(guān)系數(shù)越大[29]。我們的高通量測序結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，4℃貯存24 h的牛乳中嗜冷菌數(shù)占總菌的90%，因此實際生產(chǎn)過程中可通過構(gòu)建菌落總數(shù)與嗜冷菌數(shù)的線性模型來快速推算原料乳中嗜冷菌的數(shù)量。

3 結(jié)論

（1）原料乳貯存過程中溫度對細菌增殖的影響很大。4℃儲存條件下，原料乳嗜冷菌數(shù)及菌落總數(shù)在72 h內(nèi)并未增至2×106mL-1，10℃和15℃儲存時，原料乳的菌落總數(shù)和嗜冷菌數(shù)分別在72 h和24 h后超過國家標準規(guī)定的安全限量。

（2）嚴格控制原乳入廠后貯存溫度及時間，抑制微生物的生長代謝，保證原料乳良好的衛(wèi)生狀況是液態(tài)乳生產(chǎn)中的關(guān)鍵控制點。結(jié)合本研究中菌落總數(shù)及嗜冷菌數(shù)的分析結(jié)果，建議原料乳收購后4℃貯存不超過24 h，10℃貯存不超過16 h，15℃貯存不超過8 h。