付永巖，趙悅含，王毅超，高達(dá)，孫長(zhǎng)豹，姜瞻梅，劉飛，侯俊財(cái)

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室，哈爾濱150030）

0 引言

近年來(lái)，因高膽固醇引起的動(dòng)脈粥樣硬化及心腦血管等病發(fā)癥逐年升高，全球人類的健康受到了嚴(yán)重影響[1－2]。一些專家致力于益生菌的研究，包括其降膽固醇的益生作用逐漸被發(fā)掘，引發(fā)國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注[3]。在食品加工過(guò)程中，高效降膽固醇菌種具有重要的應(yīng)用價(jià)值，通過(guò)添加益生菌的保健食品來(lái)控制人體內(nèi)膽固醇含量，促進(jìn)和防治心腦血管的健康及疾病，極有可能成為保健食品下一個(gè)高速發(fā)展的領(lǐng)域[4－5]。

本研究旨在通過(guò)引入共沉淀、體外去除膽固醇量等方法，初探乳酸菌降膽固醇作用機(jī)理，在通過(guò)模擬胃液胰液實(shí)驗(yàn)測(cè)試菌株的耐受性以及抗生素抗性和疏水性指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)降膽固醇菌株的潛在益生特性，使之能更加有效的降低心腦血管等疾病的發(fā)病率，為以后的食品、醫(yī)療事業(yè)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

膽固醇，正乙烷和95%乙醇，鄰苯二甲醛，牛膽鹽。植物乳桿菌117-1和23-1，鼠李糖乳桿菌118-1，糞腸球菌M 53-2，乳酸乳球菌L14-3五種菌株均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室乳酸菌菌種庫(kù)提供。

1.1.1 儀器

潔凈工作臺(tái)VD-1320，電熱恒溫培養(yǎng)箱DHP-9272，DK-8D型電熱恒溫水槽，全自動(dòng)高壓滅菌鍋HVE-50，低溫冷凍離心機(jī)，離心機(jī)GL-21M，DELTA320型pH計(jì)。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）MRS液體培養(yǎng)基成分如表1所示。

表1 MRS液體培養(yǎng)基

（2）配制MRS固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入1.8%（w/v）的瓊脂。

（3）配制MRS-Oxgall-CHOL液體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入（體積分?jǐn)?shù)0.2%）疏基乙醇酸鈉，過(guò)濾除菌的100μg/mL膽固醇和3 g/L牛膽鹽。

1.2 方法

1.2.1 膽固醇含量的測(cè)定

采用鄰苯二甲醛法[6]：取1 mL樣品、6 mL 95%乙醇和4 mL質(zhì)量濃度500 g/L氫氧化鉀放入試管中，旋渦振蕩混勻。60°C恒溫水浴鍋中加熱10 min，添入10 mL正己烷，萃取20 s，添加4 mL蒸餾水，靜置15 min。吸取8 mL正己烷層，水浴氮?dú)猓?0°C）吹干。添加4 mL質(zhì)量濃度0.5 mg/mL的鄰苯二甲醛溶液（已用冰醋酸定容），靜置10 min。向每個(gè)試管內(nèi)部吸移2 mL濃硫酸，旋渦震蕩20 s，靜置顯色反應(yīng)10 min。檢測(cè)OD550nm，空白對(duì)照為未接菌的培養(yǎng)液，重復(fù)3次。

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：無(wú)水乙醇把0.1 g膽固醇粉末定容成質(zhì)量濃度1 mg/mL的溶液。配制成質(zhì)量濃度為5，10，15，20，25和30μg/mL的膽固醇溶液，參照上述方法，檢測(cè)OD550nm，并以吸光度值為縱軸，以膽固醇質(zhì)量濃度為橫軸[7]。

1.2.2 降膽固醇能力的測(cè)定

菌株活化兩代后，在MRS-Oxgall-CHOL液體培養(yǎng)基中接入體積分?jǐn)?shù)為3%的接種量，厭氧37℃下，24 h后置于離心機(jī)（轉(zhuǎn)速12 000 r/min，10 min），空白對(duì)照選用未接種菌株培養(yǎng)液。參照1.2.1的方法，按膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算膽固醇去除量，其計(jì)算公式為

式中：B和S分別為未接種菌株和接種菌株培養(yǎng)液離心上清液的膽固醇質(zhì)量濃度，μg/mL。

1.2.3 降膽固醇菌株潛在的益生特性

1.2.3.1 酸耐受性和膽鹽耐受性

制備人工胃液：用滅菌后的PBS將（1∶10000）胃蛋白酶配制成3 mg/mL的溶液，在用1 mol/L鹽酸調(diào)至成pH值為2.0和3.0，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾備用[8]。制備人工胰液：用滅菌后的PBS將（1∶250）胰蛋白酶配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL溶液，在用濃度為1 mol/L氫氧化鈉調(diào)至成pH值為7.0，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾備用。

模擬人工胃液耐受性實(shí)驗(yàn)：菌株活化兩代后，以體積分?jǐn)?shù)為2%接種量接于MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18 h。并于轉(zhuǎn)速為8 000 r/min下離心10 min，用PBS洗滌2次。將菌體重新懸浮于5 mL的的人工胃液中。在p H值為2.0人工胃液中孵育0，0.5 h和p H值為3.0下孵育0，1 h和3 h后，采用平板涂布法計(jì)算活菌數(shù)量，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

模擬人工胰液耐受性試驗(yàn)：前期處理參照模擬胃液耐受性實(shí)驗(yàn)，并重新懸浮于5 mL的人工胰液中，采用平板涂布法計(jì)算培養(yǎng)0，1，2，3 h的活菌數(shù)量，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)[9]。

存活率=處理后活菌數(shù)/未處理活菌數(shù)×100%。

1.2.3.2 抗藥性

菌種活化兩代，在15 mL的MRS瓊脂培養(yǎng)基中，添加15 mL含有10%新鮮適宜濃度菌液的軟瓊脂（0.8%的瓊脂）。在無(wú)菌條件下，將藥敏檢測(cè)紙片輕貼與冷卻后的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后觀察并測(cè)量抑菌圈直徑大小，質(zhì)控菌：金黃色葡萄球菌ATCC 25923。方法與供試菌株相同，參照美國(guó)臨床和試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)公布的藥敏試紙標(biāo)準(zhǔn)[10]，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

表2 藥敏紙片含藥量及抗性判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.3 降膽固醇的作用機(jī)理

菌株活化2次后，在MRS液體培養(yǎng)基中添加質(zhì)量濃度為2 g/L的牛膽鹽，121℃下滅菌15 min，加入除菌的100μg/mL膽固醇。

以體積分?jǐn)?shù)為2%接種量分別加入添加和未添加膽鹽的MRS-CHOL液體培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)48 h，并在轉(zhuǎn)速為5 000 r/min下，離心10 min，參照1.2.1的方法，測(cè)定膽固醇濃度（標(biāo)記為A、B）。用5 mL p H值為7.0濃度為0.1 mol/L的PBS重懸未添加膽鹽培養(yǎng)基中的菌泥（不添加膽鹽的MRS-CHOL培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌泥），取各10μL濃度為50 mg/L的溶菌酶和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的SDS添加到1 mL菌懸液中，37℃水浴1 h，超聲破碎后置于離心機(jī)中（轉(zhuǎn)速8 000 r/min，10 min）離心，測(cè)定上清液膽固醇含量（D）。將剩余菌懸液再次離心（5 000 r/min，4℃），并測(cè)定上清液膽固醇質(zhì)量濃度（C），在轉(zhuǎn)速為8 000 r/min，4℃下，用1 mL的PBS洗滌破壁處理后的剩余菌泥2次，離心10 min后棄上清，用1mL無(wú)水乙醇重懸菌泥，在5 000 r/min，10 min離心后，測(cè)定1 mL上清液膽固醇質(zhì)量濃度（E）[11－12]。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，膽固醇去除量的計(jì)算公式為

式中：F為膽酸鹽與膽固醇共沉淀量；G為菌體吸收去除膽固醇量；H為不接種的添加膽鹽的MRS-CHOL培養(yǎng)基中膽固醇質(zhì)量濃度；I為細(xì)胞膜的結(jié)合量。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel2016軟件分析數(shù)據(jù)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次；采用SPASS19.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果分析

2.1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，膽固醇的濃度與OD值的關(guān)系為y=0.0297x＋0.0377，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.993，線性相關(guān)良好。

圖1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 乳酸菌株的降膽固醇測(cè)定

通過(guò)菌體在含膽固醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)前后的膽固醇含量變化的差值評(píng)價(jià)菌株的降膽固醇能力。依據(jù)圖1所繪膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照1.2.1的方法進(jìn)行降膽固醇作用體外篩選，菌株名稱均采用原始編號(hào)。由表3可知，5株菌體外膽固醇去除率均在25%以上，對(duì)培養(yǎng)基中膽固醇的去除能力表現(xiàn)出了明顯的差異（P＜0.05），乳酸乳球菌L14-3的膽固醇去除能力最強(qiáng)，為35.90%。

表3 乳酸菌對(duì)膽固醇的去除能力

2.3 降膽固醇菌株潛在的益生特性

2.3.1 酸耐受性

5株降膽固醇菌株對(duì)人工胃液的耐受性如圖2所示。

圖2 人工胃液的耐受性

受試菌在p H值為2.0的人工胃液中孵育1 h后，無(wú)活菌檢出。由圖2（a）可知，孵育0.5 h后，植物乳桿菌117-1，23-1和鼠李糖乳桿菌118-1活菌數(shù)都下降到103mL-1水平以下，說(shuō)明這3株菌在p H值為2.0的環(huán)境下耐受性不好，存活率顯著降低。糞腸球菌M 53-2和乳酸乳球菌L14-3的活菌數(shù)顯著高于其他3株菌（P＜0.05）。

由圖2（b）可知，在pH值為3.0條件下孵育1 h后，5株菌株的活菌數(shù)并未顯著減少，鼠李糖乳桿菌118-1和植物乳桿菌23-1存活率顯著高于其他菌株（P＜0.05），說(shuō)明這兩株菌在pH值為3.0和1 h時(shí)有較好的耐受性。3 h后，5株菌的存活率均存在顯著差異（P＜0.05）。糞腸球菌M 53-2的存活率顯著高于其他4株菌，這說(shuō)明菌株M 53-2對(duì)p H值為3.0的模擬胃液有較好的耐受性，其次是乳酸乳球菌L14-3和鼠李糖乳桿菌118-1。植物乳桿菌23-1和117-1的存活率相對(duì)較低。圖2中，數(shù)據(jù)角標(biāo)不同即差異顯著（P＜0.05）。下同。

2.3.2 膽鹽耐受性

5株降膽固醇菌株對(duì)人工胰液的耐受性見圖3。5株菌在人工胰液中的存活率較高，孵育1 h后活菌數(shù)較0 h時(shí)無(wú)明顯差異。但在孵育2～3 h后，菌株存活率有所下降。孵育2 h后菌株的存活率存在顯著差異（P＜0.05），糞腸球菌M 53-2和乳酸乳球菌L14-3的存活率相對(duì)較低；在孵育3 h后，存活率最高的是鼠李糖乳桿菌118-1；存活率最低的是糞腸球菌M 53-2，活菌數(shù)降至2.07×107mL-1。綜上所述，鼠李糖乳桿菌118-1和植物乳桿菌117-1對(duì)人工胰液的耐受性更好，并且存活率顯著高于其他菌株（P＜0.05）。

圖3 對(duì)人工胰液的耐受性

2.3.3 抗藥性

5株菌株對(duì)6種抗生素的抗藥性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表4所示。表4中，5株供試菌株都至少對(duì)一種抗生素具有抗性，植物乳桿菌117-1對(duì)4種抗生素表現(xiàn)為抗性，鼠李糖乳桿菌118-1、糞腸球菌M 53-2和植物乳桿菌23-1對(duì)3種抗生素表現(xiàn)為抗性，乳酸乳球菌L14-3僅對(duì)鏈霉素表現(xiàn)為抗性。

表4 抑菌圈直徑及抗性結(jié)果

2.4 菌體吸收和共沉淀作用

表5所示為5株菌株體外膽固醇去除率，以膽固醇、膽鹽的共沉淀作用和菌體細(xì)胞吸收為去除體外膽固醇的主要形式。在培養(yǎng)過(guò)程中5株菌株均會(huì)產(chǎn)酸。酸性條件下部分膽固醇與膽鹽行成沉淀，另一部分通過(guò)菌體吸收作用而除去，少部分依靠細(xì)胞膜的結(jié)合作用。鼠李糖乳桿菌118-1通過(guò)菌體吸收作用去除的膽固醇量占總?cè)コ实谋壤罡?，?1.81%，其次是植物乳桿菌117-1和23-1，分別為27.91%、26.59%，糞腸球菌M 53-2和乳酸乳球菌L14-3最低，分別為20.66%和16.33%；乳酸乳球菌L14-3通過(guò)共沉淀作用去除的膽固醇量占總?cè)コ实谋壤罡?，?1.23%，其次是菌株M 53-2和23-1，分別為74.03%和71.28%，菌株117-1和118-1最低，分別為66.36%和63.69%。

表5 菌株體外膽固醇去除率的分布 %

3 結(jié)果與分析

現(xiàn)如今國(guó)內(nèi)外降膽固醇的作用機(jī)理尚未清晰，Rossi等人[13]認(rèn)為膽固醇通過(guò)摻入細(xì)胞膜方式，從而改變細(xì)胞膜的韌性；Gilliland[6]認(rèn)為是依靠于乳酸菌菌體的吸收作用；其他研究表明降膽固醇與菌體的膽鹽水解酶活力有關(guān)[14]。本研究中菌株通過(guò)膽固醇、膽鹽的共沉淀作用和菌體細(xì)胞吸收作用去除膽固醇所占比例大，與李昵[15]的研究結(jié)果相似。菌株118-1菌體吸收作用去除的膽固醇量占總?cè)コ实谋壤罡撸瑸?1.81%，菌株117-1和菌株23-1分別為27.91%和26.59%，菌株M 53-2和菌株L14-3最低，分別為20.66%和16.33%。說(shuō)明該5株菌具有在人體內(nèi)降低血清膽固醇的潛力。

空腹時(shí)人體胃液的pH范圍在1.3～1.8，隨著食物或乳制品的攝入升高至3.0或更高，在pH值為3下存活1.5～2 h被認(rèn)為是益生菌低p H值耐受性的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。在p H值為2.0人工胃液的條件下孵育1 h后，5種菌株均無(wú)存活，說(shuō)明抗性較差。食物在人體胃內(nèi)的停留時(shí)間大約2 h，孵育2 h后，5種菌株的活菌數(shù)均在107mL-1水平及以上，其中植物乳桿菌23-1和鼠李糖乳桿菌118-1的活菌數(shù)在108mL-1水平，較初始活菌數(shù)相差不多，說(shuō)明植物乳桿菌23-1和鼠李糖乳桿菌118-1耐酸性較好；在pH值為3.0條件下孵育3 h，5種菌株菌落數(shù)均在104mL-1水平及以上，其中糞腸球菌M 53-2和乳酸乳球菌L14-3的活菌數(shù)在106mL-1水平。說(shuō)明在p H值為3.0條件下5株菌株耐受性良好。

益生菌對(duì)腸液的耐受性更為重要，只有在腸液中定植才能發(fā)揮更好的益生作用，人體的小腸屬中性環(huán)境，故選用人工胰液pH值為8.0測(cè)定菌株對(duì)胰液的耐受性。Begley等[16]人指出：不同乳酸菌對(duì)膽汁的耐受程度不同，Usman[17]和Liong等[18]人也相繼發(fā)現(xiàn)，不同乳酸菌對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%牛膽鹽的耐受性不同，各菌株之間的耐受性有所差異。在模擬胰液的耐受性試驗(yàn)中，在p H值為8.0人工胰液條件下孵育3 h，鼠李糖乳桿菌118-1和植物乳桿菌117-1的活菌數(shù)均能維持在108mL-1左右，說(shuō)明這兩株菌對(duì)胰液具有較好的耐受性，而其他3株菌的活菌數(shù)均在107mL-1水平，對(duì)胰液的耐受性相對(duì)較弱。說(shuō)明菌株在模擬人工胃腸道環(huán)境中存活性較好。

本研究結(jié)果表明，只有植物乳桿菌117-1對(duì)萬(wàn)古霉素具有抗性。D'Aimmo等[19]研究表明，受試乳酸菌對(duì)慶大霉素表現(xiàn)為抗性，對(duì)紅霉素敏感，但是對(duì)鏈霉素、四環(huán)素的抗藥性差異較大。Zhou，N等[20]研究表明，從酸奶中分離的35株乳酸菌對(duì)鏈霉素、慶大霉素的抗藥率高于80%；秦宇軒等[21]研究表明所有供試乳酸菌均對(duì)慶大霉素和鏈霉素具有抗性，部分菌株對(duì)萬(wàn)古霉素表現(xiàn)為抗性，對(duì)紅霉素和四環(huán)素表現(xiàn)為敏感或中度敏感。以上的研究結(jié)果與本研究基本一致，在5株菌株中植物乳桿菌117-1的抗藥性最好。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，盡管降膽固醇機(jī)制有很多理論，但絕大多數(shù)是在體外以共沉淀和菌體吸收的形式來(lái)降低膽固醇，其作用機(jī)理仍需不斷深入研究。在降膽固醇乳酸菌的潛在益生性的研究中，5株菌株表現(xiàn)出能更加有效地降低高膽固醇引發(fā)的病發(fā)率潛在前景，綜合評(píng)價(jià)5株菌在模擬胃液、胰液中的存活率，表面疏水性及抗生素抗性的耐受情況，植物乳桿菌117-1和鼠李糖乳桿菌118-1抗逆性較強(qiáng)，可以為以后的食品、醫(yī)療等事業(yè)提供相應(yīng)理論依據(jù)。