張佳鋒 陳文亮 毛一凡 劉鐘 梁博程 史曉林*

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江 杭州 310005

骨質(zhì)疏松癥是一種全身性骨科疾病，其特征是骨量減少，骨微觀結(jié)構(gòu)退化，骨質(zhì)脆性增加，容易發(fā)生脆性骨折[1]。人口老齡化的加劇使得骨質(zhì)疏松發(fā)病率居高不下，其中絕經(jīng)后婦女因雌激素分泌減少等多發(fā)因素，致使骨形成與骨吸收之間的動(dòng)態(tài)平衡被打破，呈現(xiàn)高轉(zhuǎn)換特點(diǎn)，其發(fā)病率更是高達(dá)30%～60%[2]。而目前治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的藥物主要以雌激素類為主，雖有較好的臨床療效，但也容易引起較多不良反應(yīng)，如胃腸道不良反應(yīng)、乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌風(fēng)險(xiǎn)增高等[3]。因此，尋求一種更為安全且具有成本效益的藥物制劑頗有臨床意義。

筆者在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)與實(shí)踐中研究總結(jié)發(fā)現(xiàn)，促胰液素作為骨質(zhì)疏松癥差異表達(dá)蛋白，其表達(dá)水平與骨量水平正相關(guān)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠給予促胰液素治療，取得顯著療效。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供60只6月齡健康未孕雌性SD大鼠，體重200～225 g。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器、藥物、試劑

促胰液素：由浙江湃肽生物有限公司提供；乙烯雌酚：產(chǎn)自北京四環(huán)制藥二廠；PINP和CTX Elisa試劑盒：由杭州迪安醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司提供；雙能X線骨密度測(cè)量?jī)x：法國(guó)Medlink公司生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動(dòng)物造模與分組：將60只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型對(duì)照組、雌激素治療組和促胰液素治療組，每組各15只。采用雙側(cè)卵巢去除法制備絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠模型[4]，給予3%戊巴比妥鈉注射液30 mg/kg腹腔注射麻醉，假手術(shù)組只切除卵巢周圍脂肪而不切除卵巢，其余三組均將輸卵管與脂肪結(jié)扎后切除雙側(cè)卵巢。術(shù)后第1天開始注射青霉素G5萬IU以達(dá)到抗感染目的，共3 d。

1.3.2藥物干預(yù)：卵巢切除術(shù)后7 d開始藥物干預(yù)，根據(jù)黃繼漢等[5]的動(dòng)物劑量轉(zhuǎn)換公式計(jì)算劑量。假手術(shù)組給予生理鹽水1 mL/d灌胃；模型對(duì)照組給予生理鹽水1 mL/d灌胃；雌激素治療組給予乙烯雌酚水溶液0.01 mg/(kg·d)灌胃；促胰液素治療組給予促胰液素水溶液0.01 mg/(kg·d)灌胃。每日1次，持續(xù)給藥3個(gè)月。

1.3.3檢測(cè)指標(biāo)：(1)骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)檢測(cè)。藥物干預(yù)3個(gè)月后，通過右心室血液取樣處死每只大鼠，并收集每只大鼠的血液標(biāo)本送至杭州迪安醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司使用ELISA 試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定大鼠血清PINP和CTX。(2)骨密度檢測(cè)。藥物干預(yù)3個(gè)月后，使用雙能X線骨密度儀檢測(cè)大鼠腰椎骨密度。(3)蛋白相關(guān)分析：使用STRING10.0蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析工具分析骨質(zhì)疏松相關(guān)差異蛋白。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清PINP、CTX含量

模型對(duì)照組、雌激素治療組、促胰液素治療組的PINP含量較假手術(shù)組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；雌激素治療組、促胰液素治療組較模型對(duì)照組PINP含量有所降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；雌激素組與促胰液素組之間PINP含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

模型對(duì)照組的CTX含量高于假手術(shù)組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；假手術(shù)組與雌激素治療組、促胰液素治療組之間的CTX含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。雌激素治療組、促胰液素治療組較模型對(duì)照組CTX含量有所降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；雌激素組與促胰液素組之間CTX含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

組別例數(shù)PINP/(μg/L)CTX/(ng/mL)假手術(shù)組1511.66±1.160.409±0.011模型對(duì)照組1516.25±1.59*0.640±0.204*雌激素治療組1514.38±1.06*#0.411±0.128#促胰液素治療組1514.91±1.73*#0.415±0.125#

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型對(duì)照組比較，#P<0.05。

2.2 各組大鼠腰椎骨密度

各組大鼠腰椎BMD比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中模型對(duì)照組BMD明顯低于假手術(shù)組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；假手術(shù)組與雌激素治療組、促胰液素治療組之間無顯著差異(P>0.05)；雌激素治療組、促胰液素治療組較模型對(duì)照組BMD含量升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；雌激素組與促胰液素組之間無顯著差異(P>0.05)。見表2。

組別例數(shù)BMD(g/cm2)假手術(shù)組150.170±0.003模型對(duì)照組150.103±0.007*雌激素治療組150.168±0.004#促胰液素治療組150.167±0.003#

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型對(duì)照組比較，#P<0.05。

2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

通過STRING10.0蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析工具對(duì)23個(gè)相關(guān)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)建立，發(fā)現(xiàn)甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)與促胰液素(secretin，SCT)直接相關(guān)。見圖1。

圖1 SCT和PTH以及其他相關(guān)蛋白之間的相互作用Fig.1 Interaction between SCT and PTH and other related proteins

3 討論

促胰液素是由Bayliss與Starling等[6]發(fā)現(xiàn)的第一種動(dòng)物激素，屬于secretin/PACAP/VIP超家族，其受體都屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族中的B1亞族，是“激素調(diào)節(jié)”概念的先驅(qū)[7]，是一種由27個(gè)氨基酸殘基組成，含11種不同氨基酸，分子量為305.6的堿性多膚?！癝”細(xì)胞產(chǎn)生促胰液素，十二指腸粘膜是分布的主要部位，只有少量分布在胃竇、空腸和回腸中[8]。柳力公等[9]發(fā)現(xiàn)脂肪消化產(chǎn)物油酸鈉是刺激十二指腸S細(xì)胞介成和釋促胰液素的重要物質(zhì)。促胰液素具有促進(jìn)胰液分泌，增加胰液總量、能刺激胰腺分泌碳酸氫鹽、促進(jìn)消化等生理作用。肖小芹等[10]報(bào)道烏藥水提液可通過降低大鼠血清促胰液素水平來改善腹瀉型腸易激綜合征大鼠腹痛、腹瀉癥狀。金華等[11]研究發(fā)現(xiàn)胃腸激素與高血壓之間存在密切關(guān)系，研究結(jié)果表明鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯可通過下調(diào)促胰液素表達(dá)而降低自發(fā)性高血壓大鼠血壓。

促胰液素是人類小腸上部粘膜分泌的極其少量的調(diào)節(jié)胰液分泌的蛋白質(zhì)類的激素。因其治療胃潰瘍、十二指腸潰瘍有特效而被人們所注意。促胰液素釋放的因素主要是酸，當(dāng)十二指腸的pH降到3.0以下時(shí)，就會(huì)使血中的促胰液素增加，當(dāng)pH升高到4.5以上時(shí)，就抑制促胰液素的繼續(xù)釋放[12]。促胰液素能促進(jìn)胃腸、胰腺、肝膽管的水及電解質(zhì)分泌，增強(qiáng)縮膽囊素的作用和胰酶的分泌，使胰腺外分泌細(xì)胞增生肥大，使細(xì)胞內(nèi)的DNA和蛋白質(zhì)含量增加，增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)胰外分泌部的效應(yīng)，如促進(jìn)胰液分泌、抑制胃酸分泌等。促胰液素是十二指腸分泌的一種多肽，促進(jìn)膽管系統(tǒng)和胰腺導(dǎo)管分泌水和碳酸氫鹽，并可阻斷水、NA+、HCO3-的重吸收，其可與CCK協(xié)同增加胰酶分泌，可促進(jìn)胃酸分泌和胃腸運(yùn)動(dòng)[13]。黃祝等[8]研究表明，在小鼠胚胎著床過程中促胰液素在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)量增加，促進(jìn)p-cPLA2、cPLA2和mPGEs-1的表達(dá)，并通過PKA信號(hào)通路調(diào)節(jié)cPLA2/p-cPLA2的水平。Secretin及其受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛分布，其中包括海馬、下丘腦垂體軸、基底神經(jīng)節(jié)和小腦，越來越多的研究人員認(rèn)同Secretin在中樞可能發(fā)揮著多種調(diào)節(jié)作用[14]。

近期，大量研究顯示消化系統(tǒng)疾病與骨質(zhì)疏松癥關(guān)系密切，大部分胃切除、慢性胰腺炎、潰瘍性結(jié)腸炎等患者均容易出現(xiàn)骨密度低下[15-21]。這可能是消化系統(tǒng)疾病造成患者體內(nèi)促胰液素分泌減少，繼而導(dǎo)致維生素D和鈣吸收不良，腸鈣吸收較差，蛋白質(zhì)攝入減少，從而影響骨量。唐天悅等[22]研究發(fā)現(xiàn)半胱胺能夠解除生長(zhǎng)抑素對(duì)促胰液素和膽囊收縮素的抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)胰酶的合成與分泌，改善消化道對(duì)鈣和總磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化吸收率。

絕經(jīng)后婦女由于雌激素缺乏引起骨轉(zhuǎn)換的增加，破骨細(xì)胞再吸收的速度大于成骨細(xì)胞的骨形成速度，最終造成比骨累積更多的重吸收并導(dǎo)致骨的凈損失，使得骨重建的正常周期受到損害，骨吸收與骨形成之間的失衡。前期研究發(fā)現(xiàn)，促胰液素在低骨量絕經(jīng)后女性中低表達(dá)[23]，表明其可能與骨質(zhì)疏松存在密切聯(lián)系，但其參與并影響骨代謝的機(jī)制不清楚。而在本實(shí)驗(yàn)中，模型對(duì)照組的PINP、CTX含量明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，而BMD值則明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)，說明卵巢切除術(shù)后骨吸收、骨形成指標(biāo)均有增幅，但骨吸收大于骨形成，動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞，這與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥高轉(zhuǎn)換特征相一致[24-25]，證明本實(shí)驗(yàn)骨質(zhì)疏松大鼠模型造模成功。而促胰液素治療組與雌激素治療組的 PINP、CTX含量較模型對(duì)照組下降，而BMD值升高(P<0.05)，且促胰液素治療組與雌激素治療組之間無顯著差異(P>0.05)，說明促胰液素與雌激素類似，具有減緩絕經(jīng)后骨代謝高轉(zhuǎn)化趨勢(shì)，降低骨丟失速度，增加骨密度，具有抗骨質(zhì)疏松的作用。

另外，本研究使用STRING10.0蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析工具來構(gòu)建23種相關(guān)蛋白質(zhì)的相互作用網(wǎng)絡(luò)[26]，發(fā)現(xiàn)雖然SCT處于網(wǎng)絡(luò)邊緣，但與PTH直接相關(guān)。所以筆者懷疑SCT可能受PTH調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)鈣代謝，干擾Wnt、BMP/Smads、OPG/RANKL/RANK。它影響骨鈣和磷含量，抑制骨質(zhì)流失，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，雖然促胰液素與骨質(zhì)疏松之間的研究尚處于初始階段，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究揭示，但本研究顯示促胰液素具備一定的抗骨質(zhì)疏松作用，具備成為新型抗骨質(zhì)疏松藥物的潛力，為骨質(zhì)疏松的防治提供了一種新的思路與方法。