劉穎 孫昌俊 王樂 畢若杰 張恒 王大璐 齊巍

唐山市第二醫(yī)院，河北 唐山 063000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨脆性增加、導(dǎo)致骨折危險(xiǎn)性顯著升高的一種全身性骨病。骨折是OP最嚴(yán)重的并發(fā)癥，20%的OP患者有發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折(osteoporotic fracture，OPF)的可能，是致殘致死的主要原因之一[1]，因此，如何降低OPF的發(fā)生率已成為治療骨質(zhì)疏松的防治目的。OP不僅增加了患者發(fā)生骨折的風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重影響骨折愈合進(jìn)程及效果[2]。隨著我國人口的老齡化的加劇，OP及OPF的發(fā)病率逐漸上升，給家庭和社會(huì)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)是目前臨床治療骨質(zhì)疏松癥的最常用藥物之一，可調(diào)節(jié)鈣、磷代謝水平。阿侖膦酸鈉是首個(gè)以骨質(zhì)疏松為適應(yīng)證而獲準(zhǔn)上市的第三代二膦酸鹽類藥物，能顯著增加骨量，提高骨質(zhì)強(qiáng)度，降低骨折發(fā)生率。研究表明，甲狀旁腺激素聯(lián)合唑來膦酸對(duì)去勢大鼠的骨折愈合有累加作用[3]。因此，本研究旨在探討甲狀旁腺激素聯(lián)合阿侖膦酸鈉對(duì)OPF骨痂血管形成及骨折愈合的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用治療OPF提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與材料

75只SPF級(jí)雌性SD大鼠，12 W齡，體重(320±30)g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(許可證號(hào)：SYXK(京)2017-0033)。重組人甲狀旁腺激素(1-34)(100μg/支，批號(hào)：J201708072，美國Sigma公司)，阿侖膦酸鈉片(福善美)(70 mg×1 s，生產(chǎn)批號(hào)：J20170085，美國默沙東制藥有限公司)，柜式X線照片機(jī)購置于美國Hologic公司，雙能X線骨密度測定儀購于美國GE公司，MTS-858型生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)購于美國MA公司，ELISA檢測試劑盒購于武漢云克隆科技股份有限公司，兔抗鼠血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)多克隆抗體購于武漢博士德生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組與藥物干預(yù)：SD大鼠飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)屏障環(huán)境；按隨機(jī)數(shù)字法分為假手術(shù)組、去勢組、甲狀旁腺素組、阿侖膦酸鈉組、聯(lián)合用藥組，假手術(shù)組僅切除部分脂肪組織，其他4組均行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。于術(shù)后第2天分別給予不同藥物干預(yù)，假手術(shù)組、去勢組：皮下注射0.9% NaCl 5 mL/kg，1次/d；甲狀旁腺素組：皮下注射PTH(1-34)50 μg/kg，1次/d；阿侖膦酸鈉組：灌胃阿侖膦酸鈉片0.5 mg/kg，1次/d；聯(lián)合用藥組：皮下注射PTH(1-34)50 μg/kg，1次/d，灌胃阿侖膦酸鈉0.5 mg/kg，1次/d。連續(xù)用藥8周。

1.2.2構(gòu)建去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松骨折模型：10%水合氯醛腹腔麻醉，取腹背部中線第2腰椎做長約2 cm縱行切口，依次分離進(jìn)入腹腔，沿輸卵管尋找卵巢組織，嚴(yán)密結(jié)扎輸卵管，切除卵巢，逐層間斷縫合。卵巢切除術(shù)后4周行右側(cè)股骨干骨折髓內(nèi)固定術(shù)。腹腔麻醉，取左大腿外側(cè)縱行切口，暴露股骨中段，使用線鋸橫行鋸斷股骨，用電鉆以直徑1.0 mm克氏針順行插入骨折遠(yuǎn)端，骨折達(dá)到解剖復(fù)位，固定可靠且骨折端對(duì)位對(duì)線良好，逐層間斷縫合，術(shù)后常規(guī)青霉素80萬U肌肉注射，預(yù)防感染。各組大鼠均分籠飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水，飼養(yǎng)環(huán)境條件均相同。

1.2.3組織標(biāo)本處理：攝片后10%水合氯醛麻醉，采取急性大失血法處死大鼠，打開胸腔，左心室采血5～10 mL，3 000 r/min，離心15 min，收取上層血清0.5～1 mL，-20 ℃保存?zhèn)溆?。剝離股骨痂，0.9%NaCl沖洗后于10%甲醛溶液固定，10%硝酸脫鈣，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制作5 μm切片，60 ℃烤箱4 h，取出室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4放射性(X線)檢查：術(shù)后4周選取各組大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉后進(jìn)行X線攝片，觀察各組大鼠骨折愈合情況。放射學(xué)評(píng)估采用Warden[4]X線評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)估，依據(jù)骨折斷端表現(xiàn)行骨折愈合評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：沒有愈合1分；骨痂形成不明顯2分；骨折部分愈合3分；骨折線逐漸消失，骨痂逐漸吸收消失4分；完全愈合5分。

1.2.5骨生物力學(xué)檢測：采用電子生物力學(xué)測試裝置對(duì)骨折骨痂進(jìn)行三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)，儀器調(diào)試正常后固定骨標(biāo)本位置，測試區(qū)域?yàn)楣丘柚行奈恢?，以支點(diǎn)跨距為20 mm，加載速度2 mm/min給予股骨骨痂施加壓力直至骨頭斷裂，通過計(jì)算機(jī)記錄加載位移載荷-變形曲線，計(jì)算出最大荷載(N)和抗彎強(qiáng)度(N/mm)。

1.2.6骨痂骨密度(bone mineral density，BMD)測定：取出待測骨痂，在LUNAR雙能X線吸收掃描儀測量骨折部位上下區(qū)域骨密度，采用分辨率1.0 mm×1.0 mm，掃描速度60 mm/s的掃描模式，以骨折端2.0 mm×2.0 mm為中心區(qū)域，測量骨痂BMD(g/cm2)，連續(xù)測量BMD各5次。

1.2.7血清VEGF和BMP-2濃度測定：采用ELISA試劑盒檢測血清VEGF和BMP-2濃度，按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作。

1.2.8HE染色：參照HE染色法實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作[5]，光鏡下觀察染色并采集圖片。隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)新生血管數(shù)，取平均值。

1.2.9免疫組織化學(xué)染色法：以兔抗鼠VEGF多克隆抗體濃度(1∶1000)，參照免疫組織化學(xué)染色法實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作[6]。光學(xué)顯微鏡觀察并采集圖片，圖像分析軟件進(jìn)行分析，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果采用免疫反應(yīng)評(píng)分(IRS)進(jìn)行測定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組骨折愈合及評(píng)分

假手術(shù)組骨折線模糊不清或消失，骨痂生長包繞骨折端，連接緊密；去勢組骨折線依然清晰可見，未見明顯骨痂生長，斷端骨痂未連接，骨折愈合欠佳。甲狀旁腺素組和阿侖膦酸鈉組骨折線部分模糊，骨痂少量生長，骨折端骨痂部分連接，連接不緊密；聯(lián)合用藥組骨折線模糊，骨折端有連續(xù)性骨痂包繞，骨痂體積較大，部分愈合，并開始重建塑形。假手術(shù)組、去勢組、甲狀旁腺素組、阿侖膦酸鈉組、聯(lián)合用藥組骨折愈合評(píng)分分別為：4.86±0.50、2.25±0.24、3.10±0.12、3.27±0.10、4.50±0.42。去勢組較假手術(shù)組骨折愈合評(píng)分顯著降低(P<0.05)，甲狀旁腺素組、阿侖膦酸鈉組、聯(lián)合用藥組較去勢組骨折愈合評(píng)分均升高，其中以聯(lián)合用藥組骨折愈合評(píng)分升高最顯著(P<0.05)。詳見圖1。

圖1 術(shù)后4周X線情況 A：假手術(shù)組；B：去勢組；C：甲狀旁腺素組；D：阿侖膦酸鈉組；E：聯(lián)合用藥組Fig.1 X-ray situation in 4 w after operation. A: Sham operation group; B: Castration group; C: Parathyroid hormone group; D: Alendronate group; E: Combination group

2.2 各組骨痂生物力學(xué)

各組大鼠股骨骨痂生物力學(xué)比較見表1。去勢組較假手術(shù)組骨痂最大荷載和抗彎強(qiáng)度顯著降低(P<0.05)，甲狀旁腺素組、阿侖膦酸鈉組、聯(lián)合用藥組較去勢組骨痂最大荷載和抗彎強(qiáng)度均升高，其中以聯(lián)合用藥組骨痂最大荷載和抗彎強(qiáng)度升高最顯著(P<0.05)。

組別例數(shù)最大荷載/N抗彎強(qiáng)度/(N/mm)假手術(shù)組15230.80±15.30175.64±16.20去勢組15138.64±10.29※105.23±13.50※甲狀旁腺素組15166.28±12.63135.64±14.06阿侖膦酸鈉組15175.60±13.25128.20±11.24聯(lián)合用藥組15213.35±12.07#151.28±13.50#

注：與假手術(shù)組比較，※P<0.05；與去勢組比較，#P<0.05。

2.3 各組骨痂BMD比較

各組大鼠股骨骨痂BMD比較見表2。去勢組較假手術(shù)組骨痂BMD顯著降低(P<0.05)，甲狀旁腺素組、阿侖膦酸鈉組、聯(lián)合用藥組較去勢組骨痂BMD均增高，尤以聯(lián)合用藥組增高最顯著(P<0.05)。

注：與假手術(shù)組比較，※P<0.05；與去勢組比較，#P<0.05。

2.4 各組血清VEGF和BMP-2濃度比較

各組大鼠血清VEGF和BMP-2濃度比較見表3。去勢組較假手術(shù)組血清VEGF和BMP-2濃度均顯著降低(P<0.05)，甲狀旁腺素組、阿侖膦酸鈉組、聯(lián)合用藥組較去勢組血清VEGF和BMP-2濃度均升高，其中以聯(lián)合用藥組血清VEGF和BMP-2濃度升高最顯著(P<0.05)。

組別例數(shù)VEGF/(μg/L)BMP-2/(μg/L)假手術(shù)組152.57±0.322.94±0.50去勢組151.40±0.16※1.61±0.10※甲狀旁腺素組151.72±0.252.17±0.37阿侖膦酸鈉組151.80±0.301.97±0.20聯(lián)合用藥組152.32±0.35#2.58±0.42#

注：與假手術(shù)組比較，※P<0.05；與去勢組比較，#P<0.05。

2.5 各組組織學(xué)觀察

假手術(shù)組骨痂骨小梁粗細(xì)均勻，生長旺盛，排列致密有序，成骨細(xì)胞數(shù)量較多，大量新生微小血管形成。去勢組骨痂骨小梁明顯減少，生長稀疏，排列紊亂，大量纖維組織及纖維軟骨細(xì)胞。甲狀旁腺素組和阿侖膦酸鈉組骨痂骨小梁相對(duì)較少，仍較纖細(xì)，排列較稀疏，略不規(guī)則，成骨細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較少，可見新生微小血管。聯(lián)合用藥組骨小梁粗大，生長旺盛，排列致密有序，可見較多成熟的骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞，新生微小血管較多。詳見圖2。

圖2 HE染色觀察骨痂的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化(×200) A：假手術(shù)組；B：去勢組；C：甲狀旁腺素組；D：阿侖膦酸鈉組；E：聯(lián)合用藥組Fig.2 Morphological changes of bone callus were observed under HE staining (×200). A: Sham operation group; B: Castration group; C: Parathyroid hormone group; D: Alendronate group; E: Combination group

假手術(shù)組、去勢組、甲狀旁腺素組、阿侖膦酸鈉組、聯(lián)合用藥組微血管計(jì)數(shù)(個(gè)/100倍視野)分別為：3.74±0.57、1.80±0.36、2.63±0.42、2.54±0.30、3.30±0.44。去勢組微血管數(shù)顯著低于假手術(shù)組(P<0.05)，甲狀旁腺素組、阿侖膦酸鈉組、聯(lián)合用藥組較去勢組微血管數(shù)均增多，其中以聯(lián)合用藥組微血管數(shù)增加最顯著(P<0.05)。

2.6 各組VEGF表達(dá)

VEGF主要表達(dá)于成骨細(xì)胞內(nèi)及少量成熟軟骨細(xì)胞，以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色為陽性。依據(jù)免疫反應(yīng)評(píng)分得出假手術(shù)組、去勢組、甲狀旁腺組、阿侖膦酸鈉組、聯(lián)合用藥組的VEGF表達(dá)分別為：0.271±0.035、0.143±0.010、0.1885±0.015、0.205±0.020、0.238±0.028。去勢組較假手術(shù)組VEGF陽性表達(dá)顯著降低(P<0.05)，甲狀旁腺素組、阿侖膦酸鈉組、聯(lián)合用藥組較去勢組VEGF陽性表達(dá)均升高，其中以聯(lián)合用藥組VEGF陽性表達(dá)升高最顯著(P<0.05)。詳見圖3。

圖3 免疫組化觀察骨痂組織VEGF表達(dá)(×200) A：假手術(shù)組；B：去勢組；C：甲狀旁腺素組；D：阿侖膦酸鈉組；E：聯(lián)合用藥組Fig.3 The VEGF expression in callus was observed with immunohistochemistry (×200). A: Sham operation group; B: Castration group; C: Parathyroid hormone group; D: Alendronate group; E: Combination group

3 討論

骨折愈合是一個(gè)復(fù)雜但有序的骨組織再生的過程，這一過程不僅由基因表達(dá)所致的新骨組織的不斷合成與吸收，而且受到微環(huán)境(如細(xì)胞因子、生化因子、微血管)的影響[7]。甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)是骨代謝過程中重要的調(diào)節(jié)因子，在調(diào)節(jié)機(jī)體鈣磷代謝有十分重要的作用。PTH(1-34)不僅可刺激成骨細(xì)胞增殖、產(chǎn)生堿性磷酸酶及骨基質(zhì)蛋白，促進(jìn)軟骨及骨形成，從而促進(jìn)纖維性骨痂形成和改善骨痂的生物力學(xué)強(qiáng)度；而且也可以激活多種信號(hào)通路參與改善骨折愈合的過程[8]。阿侖膦酸鈉(alendronate，ALN)作為首個(gè)以骨質(zhì)疏松為適應(yīng)證而獲準(zhǔn)上市的第三代二膦酸鹽類藥物。其具有抑制骨吸收，降低骨轉(zhuǎn)換、增加骨量而降低骨折發(fā)生率、加速骨折愈合[9]。研究表明，阿侖膦酸鈉通過增加骨痂量及骨密度以增加骨骼強(qiáng)度，通過減少分解代謝抑制破骨細(xì)胞的骨吸收作用，從而提高骨折愈合的程度[10]。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是骨折愈合的關(guān)鍵性細(xì)胞因子之一，具有誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞遷移、增殖、分化成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，介導(dǎo)軟骨及骨形成[11]。其中尤以BMP-2作用最顯著，BMP-2通過一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活其下游信號(hào)分子促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和誘導(dǎo)成骨的能力，參與骨形成過程中的各個(gè)階段[12]。研究表明BMP-2干預(yù)能夠加速非骨質(zhì)疏松性骨折愈合速度，縮短愈合時(shí)間[13]。本研究表明甲狀旁腺激素聯(lián)合阿侖膦酸鈉具有協(xié)同上調(diào)BMP-2表達(dá)，增加骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨密度，改善生物力學(xué)性能及骨組織形態(tài)學(xué)，加快骨折愈合。

血管形成、恢復(fù)骨折斷端血供是骨折修復(fù)的前提。VEGF是作用最強(qiáng)的促血管生長因子，VEGF可促進(jìn)新血管生成，恢復(fù)骨折血運(yùn)，VEGF還可直接作用于骨折部位成骨細(xì)胞VEGF受體，促進(jìn)血管微環(huán)境中生長因子的表達(dá)。VEGF對(duì)原始成骨細(xì)胞有遷移趨化及分化作用，對(duì)骨的形成和重建有功能性的作用[14]。本研究結(jié)果表明甲狀旁腺激素、阿侖膦酸鈉聯(lián)合用藥通過介導(dǎo)VEGF，上調(diào)BMP-2表達(dá)，促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨痂血管形成，增加骨密度，改善生物力學(xué)強(qiáng)度及骨組織形態(tài)學(xué)，加快骨折愈合。同樣，李梅等[15]研究表明，人甲狀旁腺素和阿侖膦酸鈉均對(duì)骨質(zhì)疏松有效，聯(lián)合使用可增加骨密度和改善骨力學(xué)性能。曾中華等[16]研究表明，在骨折愈合的不同時(shí)期，BMP-2和VEGF在成骨細(xì)胞中可以互相促進(jìn)表達(dá)，共同調(diào)節(jié)骨祖細(xì)胞的增殖和成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞的分化，最終完成骨折修復(fù)。

綜上所述，甲狀旁腺激素和阿侖膦酸鈉聯(lián)合用藥具有協(xié)同促進(jìn)骨痂血管形成，進(jìn)而加快骨折愈合。聯(lián)合用藥具有潛在的臨床治療價(jià)值。但其對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折愈合不同階段具體信號(hào)調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。