王芳 陳珺 曾煦欣 陳艷芬 李衛(wèi)民

1.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006 2.廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院，廣東 廣州 510006 3.佛山科學技術學院口腔醫(yī)學院(醫(yī)藥工程學院)，廣東 佛山 528000 4.廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東 廣州 510006

對非肥胖個體和肥胖個體骨折發(fā)生率的研究表明，由體質量指數(shù)(body mass index，BMI)定義的肥胖對機體的影響是矛盾復雜的，有時肥胖會表現(xiàn)出增加某些部位骨折發(fā)生的風險，有時對機體又表現(xiàn)出保護作用[1]。黃芪散是收錄在《圣濟總錄》中治療消渴病的傳統(tǒng)制劑，含3種中藥材，分別為黃芪[Astragalus membranaceus(Fisch) Bunge]、葛根[Pueraria lobata(Willd.)Ohwi]、桑白皮(Morus alba L)。前期研究已證實其有降低體脂、體質量的作用，并對糖尿病性骨質疏松有一定預防作用[2]。但對肥胖模型動物脛骨骨結構生長的影響尚待進一步研究。骨組織形態(tài)計量學是一個對骨微觀結構、骨重建和骨代謝情況進行定量評價的研究方法，可幫助了解藥物對骨的藥理作用及產生影響的機制。本次實驗采用高脂飲食誘導肥胖模型，用骨組織形態(tài)計量學方法考察黃芪散對肥胖狀態(tài)下脛骨生長的影響，為進一步探討黃芪散對體內脂骨代謝的調節(jié)作用鋪墊基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康SD大鼠，180～200 g，7周齡，雄性，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號SYXK 2012-0125。共50只。大鼠飼養(yǎng)于SPF級動物室，喂飼全價顆粒飼料。飼養(yǎng)條件：每12 h 明暗循環(huán)，溫度21 ℃～23 ℃，濕度為50%～80%。

1.2 藥品與試劑

黃芪、葛根、桑白皮藥材均購自廣州中醫(yī)藥大學大藥房有限公司(批號160115)；黃芪散浸膏由廣州中醫(yī)藥大學科技園制備，每1 g相當于生藥1.71 g，密度1.22(50 ℃)。甲基丙烯酸甲酯(成都市科龍化工試劑廠，批號2015122201)；鄰苯二甲酸二丁酯(成都市科龍化工試劑廠，批號20130215)；過氧化苯甲酰(天津市大茂化學試劑廠，批號20160321)；無水氯化鈣(成都市科龍化工試劑廠，批號2014082201)；氫氧化鈉(廣東光華科技股份有限公司，20130123)；Toluidine Blue(Sigma Chemical Co., USA,Pcode:101745482)；Hematoxylin(Sigma Chemical Co., USA,Pcode:1000936724)；Poncean Xylidine(Sigma Chemical Co., USA,Pcode:1001223780)；Acid Fuchsin(Sigma Chemical Co., USA,Pcode:1001259386)；Phosphotungstic acid hydrate(Sigma Chemical Co., USA,Pcode:1001181095)；Orange G (Sigma Chemical Co., USA,Pcode:1001253540)；Light Green SF Yellowish(Sigma Chemical Co., USA,Pcode:1001127925)；2-Methyloxethyl acetate(纖溶劑) (Sigma Chemical Co., USA,Pcode:1001067000)；高脂飼料購自于廣東省醫(yī)學實驗動物中心，包括20%蔗糖、1.2%膽固醇、20%豬油、10%酪蛋白、0.6%磷酸氫鈣、0.4%石粉和47.8%基礎飼料(NO.D12492，SXCK 2013-0002)。

1.3 儀器

AE240電子天平(梅特勒-托利多儀器公司上海分公司)；XSZ-0800生物顯微鏡(廣西梧州市光學儀器廠)；游標卡尺(湛江市量具刃具廠)；電熱恒溫電烤箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)；炭化鎢鋼刀(德國LEICA)；LEICA2155硬組織切片機(德國LEICA)；低速鋸(Buehler LTD.USA)；JB-2型恒溫磁力攪拌器(上海雷磁儀器廠新涇分廠)；Y-FL型熒光顯微鏡(日本Nikon)；YM-Ⅲ型石膏打磨機(西北醫(yī)療儀器集團有限公司)；DHG-9097型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海醫(yī)用恒溫設備廠)；光鏡和熒光顯微鏡(日本Nikon)；數(shù)字化板(SummaSketchRIiplus)；LEICA MP30熒光顯微鏡及顯微照相機(德國LEICA)；LEICA QWN 半自動圖象分析儀(德國LEICA)。

1.4 方法

1.4.1肥胖模型大鼠的制備，動物分組及給藥：取7周齡SD大鼠50只，適應1周后，隨機均分為5組：正常組、高脂模型組、陽性對照組(立普妥)、黃芪散低劑量組、黃芪散高劑量組。正常組喂基礎飼料，其余組喂高脂飼料，高脂飼料持續(xù)喂養(yǎng)7周以形成肥胖模型。藥物組從第8 周開始灌胃給藥，持續(xù)給藥15周。黃芪散低劑量組劑量為1.2 g/(10 mL·kg)，高劑量組劑量為2.4 g/(10 mL·kg)，均混懸于10 mL0.5%阿拉伯膠樹膠中；按劑量灌胃給藥。立普妥組劑量為2 mg/kg Lipitor?。體重每兩周監(jiān)測一次。

1.4.2樣本取材方法：每只大鼠處死前第14、13天和第4、3天(處死當天為第0天倒推)分別皮下注射鈣黃綠素5 mg/kg，進行熒光標記，骨表面形成綠色雙熒光標志，可反映骨骼動態(tài)變化情況。實驗結束前1天禁食。次日處死大鼠，分離左側脛骨上段松質骨(proximal tibia metaphyses，PTM)及中段皮質骨(tibial cortex，TX)，備做不脫鈣骨切片，行骨形態(tài)計量學分析。

1.4.3骨組織形態(tài)計量學的測定：按文獻[3]操作。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 黃芪散對模型大鼠脛骨上段松質骨靜態(tài)參數(shù)的影響

與正常組相比，肥胖模型組大鼠脛骨上段骨小梁面積百分數(shù)(Tb．Ar%)(P<0.05)、骨小梁寬度(Tb.Th)顯著減少(P<0.05)，骨小梁數(shù)目(Tb.N)減少，骨小梁分離度(Tb.Sp)增加。與模型組相比，黃芪散低劑量組、高劑量組脛骨上段的Tb.Ar%、Tb.Th、Tb.N 均增加，其中黃芪散高劑量組Tb.Ar%、Tb.Th均顯著增加(P<0.01，P<0.05)。見表1。

由各組動物脛骨松質骨的切片染色圖可看出，模型組較正常組骨小梁稀疏，立普妥組和模型組骨小梁分布接近，黃芪散高低劑量組骨小梁略為密集，尤其高劑量組骨小梁間隙明顯減小。見圖1。

表1 各組大鼠脛骨上段松質骨靜態(tài)學參數(shù)的測定結果Table 1 Effect of HQS on static histomophometric parameters of PTM in each n=8)

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

圖1 肥胖模型各組大鼠脛骨上段5 μm切片Massson-Goldner Trichrome 染色(放大倍數(shù)為10×1.25) A：正常組，B：模型組，C：立普妥組，D：黃芪散高劑量組，E：黃芪散低劑量組Fig.1 The 5 μm section of proximal tibial in obese rats with Masson-Goldner Trichrome staining (10×1.25). A: Normal group, B: Model group, C: Lipitor group, D: Low-dose HQS group, E: High-dose HQS group

2.2 黃芪散對模型大鼠脛骨上段松質骨動態(tài)參數(shù)的影響

與正常組相比，立普妥組無明顯差異；模型組大鼠脛骨上段松質骨骨熒光標記周長百分數(shù)(L.Pm%)、礦化沉積率(MAR)、骨表面新骨形成率(BFR/BS)、骨轉換率(BFR/BV)均有所上升，新骨年形成率(BFR/TV)降低，但差異均不顯著。黃芪散高低劑量組各項指標都低于正常組，且高劑量組骨轉換率較正常組明顯降低(P<0.01)。與模型組相比，陽性藥物組無顯著差異；黃芪散高低劑量組各個動態(tài)學參數(shù)值均有所降低，特別是骨轉換率都顯著降低(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠上段松質骨動態(tài)學參數(shù)測定結果Table 2 Effect of HQS on PTM dynamic histomophometric parameters of obese

注：與模型組比較，##P<0.01。

綠色熒光為鈣黃綠素的雙熒光標志，可以看出，正常組脛骨組織熒光分布清晰明亮，熒光彌散分布較多，連續(xù)性好；模型組熒光強度較強，熒光分布連續(xù)，熒光帶較寬；黃芪散兩個劑量組熒光強度都較模型組弱，熒光帶較窄。立普妥組與正常組熒光強度及寬度差異不大。見圖2。

圖2 大鼠脛骨上段45 μm切片熒光標記(放大倍數(shù)為10) A：正常組，B：模型組，C：立普妥組，D：黃芪散高劑量組，E：黃芪散低劑量組Fig.2 Fluorescent of 45 μm section of PTM in rats (×10). A: Normal group, B: Model group, C: Lipitor group, D: Low-dose HQS group, E: High-dose HQS group

2.3 對模型大鼠脛骨中段皮質骨靜態(tài)參數(shù)的影響

與正常組相比，模型組大鼠脛骨皮質骨皮質面積百分數(shù)(Ct.Ar%)明顯增加(P<0.05)，骨髓面積百分數(shù)(Ma.Ar%)明顯減小(P<0.05)；立普妥組Ct.Ar%有所增加，但影響不顯著；黃芪散低劑量組差異均不顯著；黃芪散高劑量組Ct.Ar%、骨外膜參數(shù)(PL.Pm)增加，但不顯著，Ma.Ar%明顯減少(P<0.05)。見表3、圖3。

表3 各組大鼠脛骨中段皮質骨靜態(tài)學參數(shù)的測定結果Table 3 Effect of HQS on static histomophometric parameters of TX in each

注：與正常組比較，*P<0.05。

圖3 大鼠脛骨中段45 μm切片(放大倍數(shù)為10) A：正常組，B：模型組，C：立普妥組，D：黃芪散高劑量組，E：黃芪散低劑量組Fig.3 The 45 μm section of TX in rats (×10). A: Normal group, B: Model group, C: Lipitor group, D: Low-dose HQS group, E: High-dose HQS group

2.4 黃芪散對模型大鼠脛骨中段皮質骨動態(tài)參數(shù)的影響

與正常組相比，其余各組骨外膜面骨礦化沉積率(P-MAR)有增加的趨勢，以黃芪散高劑量組P-MAR值最高；模型組骨外膜面骨形成率有所降低，其余各組均高于正常組，且以黃芪散高劑量組作用明顯(P<0.01)。見表4、圖4。

表4 各組大鼠脛骨中段皮質骨動態(tài)學參數(shù)的測定結果Table 4 Effect of HQS on the middle cortical dynamic histomophometric parameters in each

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

圖4 大鼠脛骨中段45 μm切片熒光標記(放大倍數(shù)為10) A：正常組，B：模型組，C：立普妥組，D：黃芪散高劑量組，E：黃芪散低劑量組Fig.4 Fluorescent of 45 μm section of TX in rats (× 10). A: Normal group, B: Model group, C: Lipitor group, D: Low-dose HQS group, E: High-dose HQS group

3 討論

Tb.Ar%是反映骨量變化的重要指標，Tb.Th、Tb.N 和Tb.Sp則是反映微觀鏡下骨小梁結構的綜合指標。由表1和圖1的結果可見，以上參數(shù)值說明肥胖可致模型大鼠脛骨上段松質骨結構發(fā)生明顯變化，呈現(xiàn)骨質疏松狀態(tài)。黃芪散可抑制肥胖對大鼠脛骨上段松質骨產生骨丟失的影響。陽性藥立普妥組較正常組與模型組結果均無顯著性差異。由表2和圖2結果可見，肥胖造模并未導致大鼠成骨細胞活性明顯降低，脛骨上段骨形成較強，骨的更新轉換率較快；黃芪散減弱了此作用，其影響可能因為抑制骨吸收的發(fā)生。由表3和圖3結果可見，肥胖可能促進模型大鼠的脛骨中段皮質骨生長，且黃芪散高劑量組對脛骨中段皮質骨有促生長作用。由圖4和表4結果可見，骨外膜面3個參數(shù)結果都表明肥胖對模型大鼠脛骨中段皮質骨的骨形成速度無顯著影響，黃芪散可促進肥胖模型大鼠脛骨中段皮質骨橫向生長，骨的橫徑生長增大增粗，這與促進皮質骨的骨外膜面骨形成可能有關。

本實驗選取的大鼠均為雄性，未采用雌性動物，因考慮雌性鼠隨生長期成熟期飼養(yǎng)時間的延長，會出現(xiàn)絕經期后骨質疏松等癥狀，會干擾實驗考察肥胖對骨造成的影響。骨量的變化及骨的微觀結構改變是常?？疾旃怯绊懙闹笜恕９橇康膩G失體現(xiàn)在松質骨和皮質骨，本實驗取材均為大鼠脛骨部位，而沒有選用股骨或椎骨，可分別考察肥胖對脛骨上段松質骨和中段皮質骨的影響。

骨形態(tài)計量學的相關參數(shù)是由美國骨與礦物質研究學會制定的標準，包括靜態(tài)參數(shù)和動態(tài)參數(shù)。靜態(tài)參數(shù)可反映形態(tài)學觀察到的骨組織結構變化，是關系骨量和骨結構變化的重要指標。骨小梁面積百分數(shù)、骨小梁寬度和骨小梁數(shù)目的數(shù)值越高則反映骨量越多，骨小梁分離度越大，代表骨小梁之間距離越大，骨越疏松。皮質骨骨面積越大，皮質骨髓面積越小，代表皮質骨橫徑生長增強。通常情況下，這些指標出現(xiàn)變化時才對動態(tài)參數(shù)進行進一步的測定和分析[4]。從各項參數(shù)上可看出，黃芪散有利于肥胖狀態(tài)下骨骼強度的維持或增強。

利用四環(huán)素或鈣黃綠素能與骨特異結合并沉積在骨礦化前沿的特性，骨組織形態(tài)計量學中常采用活體四環(huán)素或鈣黃綠素雙標記法，在動物處死前10 d與0 d兩次將熒光劑注射于動物皮下部位，從而標記在骨重建過程中，可動態(tài)地觀察骨組織的變化，獲取動態(tài)參數(shù)信息[5]，如骨礦化沉積率、骨表面新骨形成率、骨外膜面骨形成率、骨外膜面骨礦化沉積率等骨動力學指標，反映骨形成的情況。骨礦化沉積率越大表明骨小梁表面礦化層形成的速度越快，骨表面新骨形成率、骨轉換率和新骨年形成率都是反映單位時間內單位骨面形成新的骨量的速度，以365 d為單位，骨組織面積、骨小梁周長、骨小梁面積和骨內外膜面積為不同骨面的礦化骨量。從各項參數(shù)上可以看出，肥胖導致模型動物骨轉換率增加。黃芪散對脛骨松質骨和皮質骨的影響表現(xiàn)不同，松質骨為骨低轉換狀態(tài)，抑制骨吸收的發(fā)生。而皮質骨則表現(xiàn)為促進骨形成發(fā)生。

Wong等[6]用高脂伴高碳水化合物飲食誘導代謝綜合癥考察大鼠骨密度、骨組織形態(tài)計量學、骨重建指標的影響，發(fā)現(xiàn)代謝綜合癥(向心性肥胖、高血糖為指征)使得成骨細胞表面、類骨質表面、類骨質體積顯著降低，骨吸收陷窩表面顯著增加，骨小梁體積減少。代謝綜合癥會引起骨重建的不平衡，導致骨小梁結構的退化。本次實驗也發(fā)現(xiàn)高脂飲食會導致模型大鼠骨小梁結構的退化，骨小梁數(shù)目減少，但對成骨細胞表面沒有明顯抑制作用。Lavet等[7]考察高脂高糖飲食對生長期(16周以前)和成熟期動物骨的影響，發(fā)現(xiàn)在生長期的肥胖大鼠，脛骨松質骨骨量會有所增加，而到成熟期的肥胖大鼠，松質骨骨量則減?。幻劰侵卸纹べ|骨的孔隙率在生長期會有所增加，在成熟期會增加更多。本次實驗從購進大鼠到實驗結束，大鼠從生長期成長到處死時的成熟期，最終高脂飲食致使大鼠肥胖，脛骨松質骨骨量減小，和文獻報道結果一致；但脛骨中段皮質骨面積會增大，即使到成熟期也未見骨量的降低?？紫堵适侵腹墙M織中為軟組織所充填的“腔隙部分[8]。一般認為，孔隙率的增加，骨強度會隨著下降?？紫堵蕝^(qū)分的是骨的腔隙和固體基質，而礦化指標是反映骨的礦物質部分，對反映骨剛度有較大影響。本實驗未測定孔隙率，測定了骨礦化沉積率，兩者都是反映骨材料特性的參數(shù)。本實驗發(fā)現(xiàn)高脂飲食造成的肥胖會引起脛骨松質骨的骨礦化沉積率提高，而黃芪散藥物組都會降低其值，即減弱骨形成的發(fā)生。這與一般的預期值不同，但與黃芪散降低動物體重、體脂系數(shù)等影響還是有較大關聯(lián)。前期實驗[9]筆者研究了黃芪散對骨髓間充質干細胞向脂肪細胞和成骨細胞分化的實驗考察，隨著藥物濃度的增加，成骨方向的分化趨勢會更明顯，成脂方向的分化趨勢會減弱，這與本實驗黃芪散明顯的抑制脂肪生成作用一致，但對成骨細胞的骨形成作用沒有表現(xiàn)明顯的促進作用，有待進一步實驗驗證及機理研究。

4 結論

本實驗結果可以看出，肥胖可導致大鼠脛骨松質骨骨轉換加強，呈現(xiàn)成骨、破骨活躍，骨小梁變窄，骨小梁面積變小。而立普妥對肥胖引起的骨質疏松態(tài)沒有改善作用。黃芪散可以通過抑制松質骨骨吸收和降低成骨作用，達到拮抗骨質疏松的作用。實驗中也發(fā)現(xiàn)了黃芪散也可以促進皮質骨骨形成，達到了改善骨質量的治療目的。因此，黃芪可能通過抑制骨吸收作用和促進骨外膜骨形成作用來抑制肥胖造成的骨質疏松。