朱芳兵 章英良 侯橋 張治金 嚴世貴

1.浙江中醫(yī)藥大學附屬江南醫(yī)院/杭州蕭山中醫(yī)院骨科，浙江 杭州 311200 2.浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院骨科，浙江 杭州 310009

骨質(zhì)疏松癥以骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)破壞、骨脆性增加和易于骨折為特征的代謝性骨病，骨質(zhì)疏松患者一旦發(fā)生骨折，嚴重影響老年人的生活質(zhì)量和壽命[1]。成骨細胞和破骨細胞在骨骼的發(fā)育和骨代謝過程中發(fā)揮重要作用，成骨細胞骨形成減少和破骨細胞骨吸收增加，導致骨量丟失及骨質(zhì)疏松。

仙茅苷作為中草藥仙茅中的主要生物活性成分，研究發(fā)現(xiàn)其能促進成骨細胞增殖和成骨細胞堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的活性、減少破骨細胞數(shù)、降低抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)的活性和骨吸收作用[2]，可用于骨質(zhì)疏松的治療[3]。但是仙茅苷(curculigoside，CCG)在模擬骨質(zhì)疏松體外成骨細胞培養(yǎng)環(huán)境中能否抑制炎癥因子釋放以及正向調(diào)控RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)，目前仍然不清楚。

本文通過地塞米松(dexamethasone，DEX)構(gòu)建骨質(zhì)疏松體外成骨細胞培養(yǎng)體系，系統(tǒng)研究了CCG對DEX誘導的大鼠顱骨成骨細胞增值分化、氧化損傷、炎癥細胞因子釋放以及RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)蛋白表達的影響，以期為CCG發(fā)揮防治骨質(zhì)疏松作用進一步提供理論證據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

必需培養(yǎng)基(DMEM)和胎牛血清(FBS)購于Gibco公司；I型膠原酶購于HyClone公司；Rhodamine-123(Rho-123)染料和DEX購于Sigma公司；ALP活性檢測試劑盒和酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒從南京建城生物工程研究所購買；OPG﹑β-catenin、BMP-2和GAPDH抗體購于Abcamm公司；購于美國Santa Cruz的RANKL和RANKL抗體進行Western印跡分析。

1.2 成骨細胞的分離和培養(yǎng)

將新生(3 d)Sprague-Dawley大鼠的顱骨通過順序酶消化分離成骨細胞。將顱蓋骨切碎并在37 ℃下在含有0.4%I型膠原酶的酶溶液中振蕩孵育20 min，然后用0.4%I型膠原酶孵育90 min，再用10%FBS停止消化。將細胞分別在含有10%FBS和抗生素(100 mg/mL青霉素G和100 IU/mL鏈霉素)的DMEM中培養(yǎng)。達到80%～90%匯合后，將細胞從每個培養(yǎng)瓶中取出并合并在一起。

1.3 細胞分組與處理

收集細胞并隨機分為5組：對照組(未處理組)、DEX處理組和CCG處理組(25、50和100 μg/mL)。DEX處理組，將細胞與含有1 μmol/L DEX的培養(yǎng)基一起孵育。在CCG組中，細胞與不同濃度的CCG預溫育24 h，然后與1 μmol/L DEX一起孵育。

1.4 細胞增殖測定

通過細胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8，Dojindo，Kumamoto，Japan)測定評估細胞增殖。將細胞以5×104個細胞/孔的密度接種在96孔板中，并在37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。在指定的時間點除去培養(yǎng)上清液，用PBS洗滌細胞，然后向每個孔中加入100 μL與CCK-8溶液混合的新鮮培養(yǎng)基。在37 ℃孵育1 h后，除去含有CCK-8溶液的培養(yǎng)基。使用分光光度計酶標儀(Bio-Tek，Winchester，USA)測量450 nm處的吸光度。

1.5 線粒體膜電位

用四甲基羅丹明甲酯(tetramethyl rhodamine methyl ester，TMRM)染料檢測線粒體膜電位(mitochondria membrane potential，MMP)。在6孔板上培養(yǎng)細胞(1×106個細胞/孔)。用不同濃度的CCG(25﹑50和100 μg/mL)處理24 h后，用PBS洗滌細胞，用TMRM(10 nmol/L)孵育，然后進行流式細胞術(shù)。

1.6 活性氧檢測

用流式細胞術(shù)檢測活性氧(reactive oxygen species，ROS)。按照5×104個細胞/孔在6孔板中培養(yǎng)細胞，以不同濃度的CCG(25﹑50和100 μ/mL)處理12 h后，用PBS洗滌細胞，再用10 μmol/L DCFH-DA在37 ℃下孵育20 min。用流式細胞儀測定ROS熒光強度，激發(fā)波長480 nm，發(fā)射波長525 nm。

1.7 ALP活性測定

ALP是骨細胞分化的明確標志。按照制造商的方案使用ALP測定試劑盒檢測ALP活性。在520 nm處測定樣品和標準樣品的吸光度。

圖1 CCG對DEX誘導的成骨細胞損傷的保護作用 A：DEX對細胞增殖的劑量依賴性作用。1 μmol/L DEX顯著降低孵育72 h后的細胞增殖；B：CCG預處理(25、50和100 μg/mL，24 h)抑制DEX誘導的細胞損傷。與對照相比，#P<0.05；與DEX組相比，*P<0.05。DEX：地塞米松(下同)。Fig.1 Protective effects of CCG on DEX-induced cell injury in osteoblasts. A: Dose-dependent effect of DEX on cell proliferation. DEX at 1 μM significantly reduced cell proliferation after 72 h of incubation; B: Pretreatment with CCG (25, 50 and 100 μg/mL, 24 h) alleviated DEX-induced cell injury. The data were presented as the mean±SD (n=3); #P<0.05 vs. control without any treatment group, *P<0.05 vs. the DEX only group.

1.8 酶聯(lián)免疫吸附測定

使用市售鼠特異性夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒按照制造商的方案測定成骨細胞分泌的TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2、IGF-1和M-CSF水平。

1.9 蛋白質(zhì)提取和蛋白質(zhì)印跡(Western blot)

在加1 μmol/L苯基甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA緩沖液(Beyotime)中，收集細胞并在冰上溶解30 min。等量的細胞裂解物用SDS-PAGE電泳，用適當?shù)脑屠备^氧化物酶結(jié)合的次級抗體進行Western blot分析。BMP-2(1∶1000)、β-catenin(1∶1000)、RANKL(1∶500)、RANK(1∶1000)、OPG(1∶1000)和GAPDH(1∶1000)在4 ℃下孵育。

1.10 統(tǒng)計學分析

通過GraphPad Prism 5(GraphPad Software，La Jolla，CA)分析并通過t檢驗評估不同組之間的差異，至少3次獨立重復的實驗數(shù)據(jù)采用平均值±標準差表示。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CCG保護成骨細胞免受DEX誘導的細胞損傷

DEX(0.01～10 μmol/L)以劑量和時間依賴性的方式顯著降低細胞增殖，1 μmol/L DEX處理后細胞增殖降低至對照組的35.7%(圖1 A)。但研究發(fā)現(xiàn)，CCG以25、50和100 μg/mL的劑量預處理24 h顯著保護成骨細胞免受DEX誘導的細胞損傷，并與劑量正相關(guān)(圖1B)。

2.2 CCG提高DEX抑制的成骨細胞分化

如圖2A所示，DEX誘導的成骨細胞的ALP活性略有下降。用CCG以25、50和100 μg/mL的劑量預處理成骨細胞24 h顯著增強ALP的活性(圖2B)。如圖3所示，用DEX(1 μmol/L)處理刺激了RANKL和RANK的表達，并且抑制了OPG、BMP-2、β-catenin、IGF-1和M-CSF的表達。然而，劑量為25、50和100 μg/mL的CCG顯著下調(diào)DEX刺激的RANKL和RANK表達，但是增加成骨細胞中OPG、BMP-2、β-catenin、IGF-1和M-CSF的表達。

2.3 CCG抑制DEX誘導的線粒體凋亡途徑

MMP的缺失與線粒體凋亡途徑有關(guān)。如圖4 A所示，DEX(1 μmol/L)處理成骨細胞可引起MMP中度去極化。然而，CCG處理24 h后，呈劑量依賴性提高MMP水平。另一方面，活性氧的生成也與線粒體有關(guān)。如圖4B所示，DEX(1 μmol/L)處理成骨細胞后，細胞內(nèi)活性氧積累明顯增加。而CCG處理24 h后，劑量依賴性地顯著降低ROS的積累。

圖2 在DEX條件下CCG改變ALP的活性 A：用含有0﹑0.01﹑0.1﹑1或10 μmol/L DEX的培養(yǎng)基處理細胞，ALP活性降低；B：細胞用25﹑50和100 μg/mL的CCG預處理24 h，然后與另外的1 μmol/L DEX一起溫育。與對照相比，#P<0.05；與DEX組相比，*P<0.05。Fig.2 The activity of ALP is altered by CCG under DEX condition. A: The cells were treated with medium containing 0, 0.01, 0.1, 1 or 10 μM of DEX and the activity of ALP was decreased; B: The cells were pretreated with 25, 50 and 100 μg/mL of CCG for 24 h, and then incubated with an additional 1 μM of DEX. The data were presented as the mean±SD (n=3); #P<0.05 vs. control without any treatment group, *P<0.05 vs. the DEX only group.

圖3 CCG對成骨細胞分化相關(guān)標志物表達的影響 A、B：5個處理組中BMP-2、β-catenin、RANKL、OPG和RANK表達譜的蛋白質(zhì)印跡(左)和定量分析(右)；C、D：ELISA分析5組中的IGF-1和M-CSF蛋白質(zhì)表達。與對照相比，#P<0.05；與DEX組相比，*P<0.05。Fig.3 The effects of CCG on the expression of osteoblastic differentiation associated markers. A, B: Western blotting (left) and quantification (right) of BMP-2, b-catenin, RANKL, OPG and RANK expression profiles in five treatment groups; C, D: ELISA analyzed IGF-1 and M-CSF protein expression in five treatment groups. The data were presented as the mean±SD (n=3); #P<0.05 vs. control without any treatment group, *P<0.05 vs. the DEX only group.

圖4 CCG對DEX誘導成骨細胞MMP和ROS的影響 A：DEX誘導的成骨細胞分別予以25、50和100μg/mL的CCG預處理24 h，然后用TMRM孵育，流式細胞儀分析；B：將DEX誘導的成骨細胞分別予以25、50和100μ/mL的CCG預處理24 h，用熒光探針DCFH-DA測定ROS的生成水平。與對照相比，#P<0.05；與DEX組相比，*P<0.05。Fig.4 The effects of CCG on MMP and ROS in DEX-induced osteoblasts. A: DEX-induced osteoblasts were pretreated with CCG for 24 h at 25, 50 and 100 μg/mL respectively, then incubated with TMRM and analyzed by flow cytometry; B: DEX-induced osteoblasts were pretreated with CCG for 24 h at 25, 50 and 100 μg/mL respectively, and fluorescence probe DCFH-DA was used to determine the levels of ROS production. The data were presented as the mean±SD (n=3); #P<0.05 vs. control without any treatment group, *P<0.05 vs. the DEX only group.

2.4 CCG對DEX誘導的成骨細胞中促炎細胞因子表達的影響

如圖5所示，DEX(1 μmol/L)治療可增加TNF-α、IL-1β、IL-6和COX-2的表達。與DEX治療組相比，CCG以劑量依賴性的降低炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-6和COX-2的表達。

圖5 CCG對促炎細胞因子表達的影響。在5組中TNF-α(A)、IL-1β(B)、IL-6(C)和COX-2(D)蛋白表達的ELISA分析。與對照相比，#P<0.05；與DEX組相比，*P<0.05Fig.5 The effects of CCG on the expression of pro-inflammatory cytokines. ELISA analysis of TNF-α (A), IL-1b (B), IL-6 (C), and COX-2 (D) protein expression in five treatment groups. The data were presented as the mean±SD (n=3); #P<0.05 vs. control without any treatment group, *P<0.05 vs. the DEX only group.

3 討論

3.1 CCG對氧化應激的影響

成骨細胞骨形成和破骨細胞骨吸收在骨重塑過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，受多種因素的調(diào)控，包括雌激素、炎癥和氧化應激[4-5]。氧化應激被認為是導致各種退行性疾病(如動脈粥樣硬化、骨質(zhì)疏松癥和癌癥)的重要原因，這些患者中氧化應激相關(guān)標志物的水平顯著增加[6]。在細胞水平，氧化應激激活一系列的信號傳導途徑誘導細胞從增殖、分化到凋亡的廣泛損傷[7]。先前的研究表明，DEX抑制骨髓來源的人間充質(zhì)干細胞和MC3T3-E1細胞中成骨細胞的分化過程[8]。本研究同樣證實DEX明顯抑制成骨細胞的分化，降低成骨細胞ALP活性。而CCG明顯減少ROS產(chǎn)生，提高MMP水平，促進成骨細胞增值和分化。類似的，也有文獻報道發(fā)現(xiàn)，當CCG和過氧化氫同時處理成骨細胞時，CCG明顯抑制過氧化氫對成骨細胞的氧化損傷，促進成骨細胞分化，增強成骨細胞活性[9]。這些結(jié)果表明CCG有效保護成骨細胞免受氧化應激損傷，促進成骨細胞增值分化和增強成骨活性，有望提高骨密度用以骨質(zhì)疏松癥治療。

3.2 CCG對RANKL/OPG系統(tǒng)的影響

成骨細胞不僅參與骨形成，還通過產(chǎn)生RANKL和OPG來調(diào)節(jié)破骨細胞的形成、分化和骨吸收活性[10-11]。RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)不僅參與調(diào)節(jié)生理性骨重建，也與病理條件下多種骨病的發(fā)生密切相關(guān)。RANKL主要由成骨細胞和骨髓基質(zhì)細胞分泌，與破骨前體細胞或破骨細胞表面上的膜受體RANK結(jié)合后，引起一系列細胞生物學反應，促進破骨細胞的分化成熟及骨吸收活性。OPG又稱破骨細胞分化抑制因子，主要由成骨細胞和骨髓基質(zhì)細胞分泌，OPG作為RANKL的誘餌受體，可通過與RANK競爭性結(jié)合RANKL，從而阻斷骨吸收信號的傳遞，抑制破骨細胞分化成熟和成熟破骨細胞的骨吸收活性并誘導其凋亡。因此，RANKL/OPG比例協(xié)調(diào)是調(diào)節(jié)局部骨代謝平衡的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，CCG提高人羊水源性干細胞成骨分化過程中的堿性磷酸酶活性和鈣沉積，提高OPG與RANKL的比值，上調(diào)β-catenin表達[12]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)CCG提高OPG與RANKL的相對比值，提示CCG可能有效抑制破骨細胞的生成，但尚需要進一步研究證實。

3.3 CCG對炎癥因子釋放的影響

各種炎癥細胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6在調(diào)節(jié)破骨細胞以及骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[13-17]。在骨質(zhì)疏松性骨折女性中，促破骨細胞生成性細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達明顯高于正常絕經(jīng)后婦女[18]。TNF-α能促進已經(jīng)與RANKL結(jié)合的破骨細胞前體細胞分化為破骨細胞；也能直接激活成熟破骨細胞，抑制破骨細胞凋亡，增加成熟破骨細胞成活率[18]。本文結(jié)果顯示，CCG減少了細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和COX-2表達，提示CCG也可能通過抑制促炎性細胞因子表達抑制破骨細胞生成。

綜上所述，CCG保護成骨細胞免受DEX誘導的氧化應激損傷，促進成骨細胞增值分化和提高成骨活性，同時抑制促破骨細胞生成細胞因子表達及正向調(diào)控OPG與RANKL比值以抑制破骨細胞生成。這些結(jié)果為CCG影響骨代謝過程提供了新的見解，提示CCG可作為一種新的選擇用于預防和治療骨質(zhì)疏松癥。