訾慧 范穎 蔣寧 谷麗艷 董秀

遼寧中醫(yī)藥大學中醫(yī)臟象理論及應用教育部重點實驗室，遼寧 沈陽 110847

骨質疏松癥是一種增齡性病變，隨著人口老齡化，增齡導致骨質疏松癥及其骨折的發(fā)病率逐年上升，并成為嚴重的醫(yī)學和社會問題。中醫(yī)認為“腎藏精生髓主骨”，腎主藏精，精生髓，髓養(yǎng)骨。中醫(yī)認為“腎藏精生髓主骨”，腎主藏精，精生髓，髓養(yǎng)骨。腎中精氣旺盛則骨就強壯，否則反之?！澳I精”也擔負成年組織修復的功能。如《靈樞·海論》云：“髓海有余，則輕勁多力；自過其度，髓海不足，則腦轉耳鳴，脛酸眩冒，目無所見，懈怠安臥”。現代醫(yī)學研究證明，干細胞是具有多向分化潛能的成體干細胞，以骨髓組織中含量最為豐富。骨髓間充質干細胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)是一種多能間充質干細胞，在一定條件下可以向成骨方向分化，可能受多種信號通路調控，其中BMP/Runx2/OSX信號通路是與骨形成密切相關的通路，能促進成骨分化[1]。骨髓間充質干細胞的分化能力與分化方向體現了骨髓的功能，因此認為補“腎”可以提高骨髓間充質干細胞的分化能力[2-3]。

淫羊藿為中醫(yī)臨床補腎壯骨常用藥材，淫羊藿苷為其主要有效成分，具有明顯的促進骨形成、抑制骨吸收的活性[4-6]。淫羊藿苷口服給藥后，在體內會產生多種代謝產物如淫羊藿素、淫羊藿次苷I、淫羊藿次苷Ⅱ等，且原型藥物生物利用度較低[7]。賈曉斌等[8]發(fā)現淫羊藿苷經口給藥發(fā)揮主要功效的物質基礎主要為其代謝產物，翟遠坤等[9]曾報道淫羊藿苷的代謝產物具有強于其本身的生物活性。筆者[10]前期實驗結果也表明，淫羊藿次苷I與其原型藥物淫羊藿苷相比，有更好的促進骨髓間充質干細胞成骨分化的生理活性。本文通過體外誘導成骨細胞系統，研究淫羊藿次苷Ⅰ和淫羊藿次苷Ⅱ對BMP/Runx2/OSX信號通路的影響，探討其可能作用機制，同時比較兩者的作用強度，為開發(fā)新藥和發(fā)掘中醫(yī)藥潛在價值奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品

試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco，USA)；甘油磷酸鈉、磷酸化抗壞血酸(ASAP)、地塞米松、二甲基亞砜(DMSO)均購自Sigma公司；MEM-α細胞培養(yǎng)液(GIBCO 12571-063)、堿性磷酸酶(alkaline phosphates，ALP)測定試劑盒(AE91640Ra，批號：201512)；骨鈣素(BGP)檢測試劑盒(AE90937Ra，批號: 201512)；Ⅰ型膠原蛋白測定試劑盒(AE90739Ra，201512)；BMP-2測定試劑盒(AE90181Ra，201512)；NOGGIN重組蛋白(Peprotech公司，美國)；β-甘油磷酸鈉和茜素紅(美國Sigma-Aldrich)；類標準胎牛血清(蘭州民海生物工程有限公司)；RNAisoReagent、TaqDNA 聚合酶、反轉錄試劑盒、EasyDilution 稀釋液均購自TaAaRa 公司，引物由TaAaRa 公司設計合成。

藥品：淫羊藿次苷I(批號：121020)和淫羊藿次苷Ⅱ(批號：121117)均購自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司(純度大于98%)。

1.2 儀器

二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(THERMO FORMA 3110)、酶標儀(BIO-TECK Synergy H1)；蛋白核酸分析儀(DU640，美國貝克曼)；低溫高速離心機(MR1822，法國Jouan SA)。

1.3 方法及檢測指標

1.3.1骨髓間充質干細胞培養(yǎng)及分組：大鼠BMSCs購于廣州賽業(yè)有限公司，批號： 090405B01。采用胰蛋白酶消化法進行大鼠骨髓間充質干細胞的傳代。

實驗分組：①空白對照組：DMEM+10 mL/dL胎牛血清(含100 U/mL青、鏈霉素)，即基礎培養(yǎng)液；②陽性轉化液組： DMEM +10 mL/dL胎牛血清(含 100 U/mL青、鏈霉素)+0.1 mol/L地塞米松+50μg/mL維生素C+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉，即成骨誘導液；③抑制劑組：成骨誘導液+1μg/mL Noggin；④淫羊藿次苷Ⅰ組：基礎培養(yǎng)液+淫羊藿次苷Ⅰ1×10-5mol/L；⑤抑制劑+淫羊藿次苷Ⅰ組：基礎培養(yǎng)液+淫羊藿次苷Ⅰ1×10-5mol/L+1μg/mL Noggin；⑥淫羊藿次苷Ⅱ組：基礎培養(yǎng)液+淫羊藿次苷Ⅱ1×10-5mol/L；⑦抑制劑+淫羊藿次苷Ⅱ組：基礎培養(yǎng)液+淫羊藿次苷Ⅱ1×10-5mol/L+1μg/mL Noggin。

1.3.2ALP 活性測定：采用ELISA法于成骨性誘導培養(yǎng)第6、9、12天檢測ALP水平。具體方法按試劑盒說明進行，顯色后于酶聯儀450 nm處測定光密度D(λ)值，空白調零，繪制標準曲線，根據樣品的光密度值在回歸方程上計算對應的樣品濃度以μg/L表示。

1.3.3礦化結節(jié)染色：將BMSCs 細胞接種后，使用成骨誘導培養(yǎng)基，放置于5.0% CO2，37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，進行上述各組藥物干預，誘導14 d 以后將待測孔的培養(yǎng)基吸出，用茜素紅染色方法染色，在倒置顯微鏡下觀察。

1.3.4測定蛋白表達量：BGP、Ⅰ型膠原蛋白(COL-Ⅰ)、BMP-2蛋白濃度。采用ELISA法于成骨性誘導培養(yǎng)第12天，檢測BGP、COL-Ⅰ、BMP-2含量，具體方法按試盒說明進行。用酶聯儀在450 nm波長依序測量各孔的吸收度(OD值)，繪制標準曲線，計算樣品的實際濃度以μg/L表示(按說明書進行)。

1.3.5檢測基因表達量：藥物干預48 h，提取細胞RNA，實時定量PCR檢測相關基因(ALP、BGP、Osterix、Runx2)表達量。RT-Real Time PCR 所用引物序列見表1。

表1 RT-Real Time PCR 所用引物序列Table 1 Primer sequences for real time RT-PCR

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 對ALP活性的影響

ELISA法檢測各組在第6、9、12天ALP的水平。與空白對照組比較，淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ組細胞內ALP水平均有升高(P<0.05)，隨著反應時間延長，細胞裂解液中ALP水平逐漸上升，第12天達到最高水平，達到陽性轉化液組的80%以上。相應抑制劑組，BMSCs ALP活性明顯降低。淫羊藿次苷Ⅰ組與淫羊藿次苷Ⅱ組比較，ALP活性在第9、12天，前者明顯強于后者，且差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

2.2 對細胞礦化結節(jié)的影響

礦化結節(jié)的出現是鑒定成骨細胞分化成熟的特征性標志，典型的礦化結節(jié)呈紅褐色。可以看到，陽性轉化液組(B)的礦化結節(jié)數目最多，連接成片，且體積較大；淫羊藿次苷Ⅰ組(C)和淫羊藿次苷Ⅱ組(D)的礦化結節(jié)均較空白對照組(A)多，且體積明顯增大，其中淫羊藿次苷Ⅰ組的礦化結節(jié)多于淫羊藿次苷Ⅱ組。抑制劑組(E)的礦化結節(jié)數量明顯少于陽性轉化液組，且體積偏小，礦化水平降低；淫羊藿次苷Ⅰ+抑制劑組(F)及淫羊藿次苷Ⅱ+抑制劑組(G)組的礦化結節(jié)數量明顯少于相應的淫羊藿次苷Ⅰ組及淫羊藿次苷Ⅱ組，且體積偏小，礦化水平降低。如圖1所示。

表2 各組內第6、9、12 天的BMSCs ALP活性比較 Table 2 Comparison of ALP activity between each group on day 6, 9, and 12 after osteogenic induction

注：與空白對照組同期比較，★P<0.05；與相應各組第6天比較，*P<0.05；與陽性轉化液組同期比較，△P<0.05；淫羊藿次苷Ⅰ組與淫羊藿次苷Ⅱ組同期比較，▲P<0.05；抑制劑組與相應藥物組即⑤組與④組、⑦組與⑥組相比，□P<0.05。

圖1 各組對細胞礦化結節(jié)的影響(茜素紅染色，×40) A：空白對照組； B：陽性轉化液組；C：淫羊藿次苷Ⅰ組；D：淫羊藿次苷Ⅱ組；E：抑制劑組；F：淫羊藿次苷Ⅰ+抑制劑組；G：淫羊藿次苷Ⅱ+抑制劑組(放大倍數×40)Fig.1 Effects on mineralized nodule in BMSCs in each group (Alizarin red staining, ×40). A: Blank control group; B: Positive transformation solution group; C: Icariin I group; D: Icariin II group; E: Inhibitor group; F: Icariin I + inhibitor group; G: Icariin II + inhibitor group (×40)

2.3 對骨髓間充質干細胞成骨分化過程中BGP、COL-Ⅰ、BMP-2蛋白表達的影響

BGP、COL-Ⅰ、BMP-2的蛋白表達量隨著培養(yǎng)時間的延長而增加，在第12天達到了高峰值。與空白對照組比較，淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ組細胞BGP、COL-Ⅰ、BMP-2表達量均明顯增加(P<0.05)；與陽性對照液組比較，淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ組各因子蛋白表達量差異有統計學意義(P<0.05)，但其活性已達到陽性轉化液組的80%以上；相應抑制劑組細胞BGP、COL-Ⅰ、BMP-2表達量均顯著降低，即⑤組與④組相比及⑦組與⑥組相比，差異有統計學意義(P<0.05)；淫羊藿次苷Ⅰ與淫羊藿次苷Ⅱ組比較，淫羊藿次苷Ⅰ對促進BGP蛋白表達明顯強于淫羊藿次苷Ⅱ，且差異有統計學意義(P<0.05)，對 COL-Ⅰ、BMP-2的蛋白表達量，兩者差異無統計學意義。詳如表3。

組別BGP COL-1 BMP-2 ①空白對照組26.304±0.2456.121±0.3717.225±0.128②陽性轉化液組51.263±0.661★12.371±0.316★11.833±0.233★③抑制劑組25.688±0.635△5.379±0.152△5.0285±0.129★△④淫羊藿次苷Ⅰ組44.879±0.919★△▲10.507±0.251★△9.548±0.193★△⑤淫羊藿次苷Ⅰ+抑制劑組33.359±1.424★△□7.578±0.259★△□7.239±0.149★△□⑥淫羊藿次苷Ⅱ組40.951±0.919★△10.145±0.326★△9.364±0.099★△⑦淫羊藿次苷Ⅱ+抑制劑組32.515±1.233★△□7.358±0.176★△□7.223±0.091△□

注：與空白對照組比較，★P<0.05；與陽性轉化液組比較，△P<0.05；淫羊藿次苷Ⅰ組與淫羊藿次苷Ⅱ組比較，▲P<0.05；抑制劑組與相應藥物組即⑤組與④組、⑦組與⑥組相比，□P<0.05。

2.4 對BMSCs骨向分化過程中BMP/RunX2/OSX信號通路相關因子ALP、BGP、Osterix、Runx2 mRNA表達的影響

淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ均可上調ALP、BGP，Runx2，并進一步調節(jié)其下游基因Osterix的轉錄表達。與空白對照組比較，淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ組ALP、BGP，Runx2及Osterix mRNA表達明顯增強(P<0.05)；與陽性對照液組比較，淫羊藿次苷Ⅰ對各因子mRNA表達差異有統計學意義(P<0.05)，但其活性較強。淫羊藿次苷Ⅱ對ALP、Osterix的mRNA表達與陽性對照組無明顯差異；相應抑制劑組相關轉錄因子表達量明顯降低，即⑤組與④組、⑦組與⑥組相比，差異有統計學意義(P<0.05)；淫羊藿次苷Ⅰ與淫羊藿次苷Ⅱ組比較，對Osterix因子mRNA的表達差異有統計學意義(P<0.05)，后者明顯強于前者，對其他各因子mRNA的表達二者無顯著性差異。詳見表4。

表4 各組細胞ALP、BGP、Osterix、Runx2 mRNA表達水平比較Table 4 Gene expression of ALP, BGP, Osterix, and RUNX2 in each group n=5)

注：與空白對照組比較，★P<0.05；與陽性轉化液組比較，△P<0.05；淫羊藿次苷Ⅰ與淫羊藿次苷Ⅱ組比較，▲P<0.05；抑制劑組與相應藥物組即⑤組與④、⑦組與⑥組相比，□P<0.05。

3 討論

3.1 骨髓間充質干細胞成骨分化

骨髓間充質干細胞是骨髓中成骨細胞的祖細胞，在一定條件下可以成骨分化。BMSCs向成骨分化的重要表現如早期出現的標志物成骨細胞早期分化程度的堿性磷酸酶及較晚出現的作為成骨細胞向新骨生成過程特異性指標的骨鈣素等。

3.2 BMP/Runx2/Osx信號通路與成骨分化

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)是轉化生長因子(TGF-β)超家族的一員，可誘導骨髓間充質干細胞向成軟骨細胞，成骨細胞和成牙本質細胞分化，促進成骨細胞功能。如BMP-2是促進骨形成最重要的細胞外信號分子之一[11]。成骨細胞的分化受多種信號通路調控，而其中BMP/Smads/Runx2/Osx信號通路與骨形成密切相關。BMP-2通過激活Smads信號傳導和調節(jié)成骨基因轉錄如BMP-2、Runx2、Osterix等，而發(fā)揮其成骨作用。該信號通路同時受到抑制性smads和細胞外BMPs拮抗劑(如Noggin)等的調控[12]。

Runx2作為BMP-2的靶基因，直接調節(jié)成骨細胞特異性基因的表達，包括骨鈣素、I型膠原和堿性磷酸酶等，在骨形成的多個階段起調控作用。Osterix是Runx2的下游靶基因，受到Runx2的轉錄調控。Osterix是成骨細胞晚期分化所必需的特異性轉錄因子，調控多種重要的成骨基因的表達，如OC、骨粘素、骨橋素、骨鈣素和Ⅰ型膠原蛋白等，對骨細胞的分化成熟和骨質形成有重要影響。Osterix與 Runx2調控成骨細胞不同的分化階段。

本實驗茜素紅染色對細胞礦化結節(jié)的影響結果表明，淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ均具有促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞增殖分化的趨勢。ELISA實驗結果顯示，淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ均能促進ALP細胞活性，促進BGP、COL-Ⅰ、BMP-2的蛋白表達量，且隨著干預時間延長而呈上升趨勢，至第12天達到最高。與陽性對照液組比較，淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ組仍存在顯著性差異，但其活性已達到陽性轉化液組的80%以上。淫羊藿次苷Ⅰ與淫羊藿次苷Ⅱ組比較，淫羊藿次苷Ⅰ對ALP活性、BGP蛋白表達均明顯強于淫羊藿次苷Ⅱ；對 COL-Ⅰ、BMP-2的蛋白表達量，兩者無顯著性差異。

RT-PCR結果顯示，淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ均可顯著上調成骨相關轉錄因子ALP、BGP、Runx2，并進一步調節(jié)其下游基因Osterix的轉錄表達，與空白對照組比較，具有顯著性差異(P<0.05)；與陽性對照液組比較，淫羊藿次苷Ⅰ對各因子蛋白表達量存在顯著性差異(P<0.05)，但其活性較強。淫羊藿次苷Ⅱ對ALP、Osterix的mRNA表達與陽性對照組無明顯差異；淫羊藿次苷Ⅰ與淫羊藿次苷Ⅱ組比較，對Osterix因子mRNA的表達，二者具有顯著性差異(P<0.05)，后者明顯強于前者；對ALP、BGP、Runx2因子mRNA的表達二者無顯著性差異。

本研究表明，中藥淫羊藿中的主要有效成分淫羊藿苷的代謝產物淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ，在體外能通過激活BMP/Runx2/Osx信號通路相關基因表達，提示可能通過促進 BMP-2蛋白，繼而調控靶基因Runx2、Osterix的表達，進而促進BMSCs的成骨轉化。BMP信號通路的阻滯劑(1 μg/mL Noggin重組蛋白)能明顯抑制1×10-5mol/L淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ對BMSCs定向成骨分化的作用。本實驗結果與翟遠坤等[9]研究的淫羊藿次苷Ⅱ促進BMSCs成骨性分化的活性高于淫羊藿苷的實驗結果具有一致性。

但是，其促進BMSCs定向成骨分化的信號轉導通路可能含有多條且交錯成網，其作用機制仍有待進一步深入研究。賀龍剛[13]等研究結果證明，淫羊藿次苷Ⅰ及其代謝產物淫羊藿次苷Ⅱ在體外均能通過AP-1/NFATc1信號通路抑制破骨細胞生成，且淫羊藿次苷Ⅱ作用優(yōu)于淫羊藿次苷Ⅰ。翟遠坤等[14]研究表明，淫羊藿次苷Ⅱ通過激活雌激素信號通路促進骨髓間充質干細胞的成骨性分化。但通過BMP/Runx2/Osx信號通路研究淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ對大鼠骨髓間充質干細胞成骨分化的實驗研究本文尚屬首次。

同時研究發(fā)現，淫羊藿次苷Ⅰ對ALP活性、BGP蛋白表達促進作用顯著強于淫羊藿次苷Ⅱ；淫羊藿次苷Ⅱ對Osterix mRNA的表達要明顯強于淫羊藿次苷Ⅰ。淫羊藿次苷Ⅰ雖然能夠促進ALP活性、BGP蛋白表達，但對下游Osterix基因表達作用弱于淫羊藿次苷Ⅱ。該結果提示可能與兩者化學結構上3位和7位取代基的不同有關。另外，淫羊藿次苷Ⅱ為淫羊藿次苷Ⅰ體內代謝產物，提示淫羊藿次苷Ⅰ可能通過生物轉化成淫羊藿次苷Ⅱ，進一步增強對BMP/Runx2/Osx信號通路下游基因的調控，從而促進BMSCs定向成骨分化。這些可能是兩者活性差異的主要原因，但具體機理還需做進一步的研究。