崔夢君，董蘊(yùn)，單春會，蔡文超，張振東，郭壯

（1.湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北襄陽441053；2.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832003）

0 引言

在現(xiàn)代食品加工產(chǎn)業(yè)中，乳酸菌是生產(chǎn)發(fā)酵乳常用的發(fā)酵劑菌種之一，具有調(diào)整腸道菌群、預(yù)防代謝綜合征和增強(qiáng)免疫等諸多作用，在嬰幼兒配方奶粉和保健食品中亦有著廣泛的應(yīng)用[1]。通過模擬人的味覺系統(tǒng)，電子舌實(shí)現(xiàn)了奶酪[2]、牛奶[3]和酸奶[4]等乳制品滋味品質(zhì)的數(shù)字化評價[5]。通過模擬人的嗅覺系統(tǒng)，電子鼻基于金屬氧化物傳感器矩陣，實(shí)現(xiàn)了食品中典型揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的定量分析[6]，目前在奶粉[7]、羊酸奶[8]和冰激凌[9]等乳制品風(fēng)味品質(zhì)評價中有著廣泛的應(yīng)用。本研究對襄陽地區(qū)青年人腸道中乳酸菌進(jìn)行了鑒定，同時采用電子舌和電子鼻技術(shù)對部分分離株制備的發(fā)酵羊乳品質(zhì)進(jìn)行了評價，以期為后續(xù)具有良好羊乳發(fā)酵特性乳酸菌的篩選提供菌株支持。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑及儀器設(shè)備

1.1.1 材料

全脂羊乳粉和蔗糖。

生化試劑：MRS培養(yǎng)基，rTaq，DNA聚合酶，溶菌酶，蛋白酶K，10×PCR buffer，引物（27F/1495R），d NTP Mix，2×PCR mix，p MD18-T克隆載體，Axygen PCR清潔試劑盒和Escherichia coli top10。

普通化學(xué)試劑：氯化鈉、醋酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨、十二烷基硫酸鈉、碳酸鈣、酚、氯仿、異戊醇、異丙醇、乙醇、陽離子溶液、陰離子溶液、參比溶液、乳酸、檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸、乙酸、磷酸二氫鉀、甲醇、乙腈、異丙醇和磷酸。

1.1.2 設(shè)備

DG250厭氧工作站，LRH-150生化培養(yǎng)箱，LXJIIB低速大容量多管離心機(jī)，vetiri梯度基因擴(kuò)增儀，DYY-12電泳儀，ECLIPSE Ci生物顯微鏡，UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)，SA-402B電子舌，PEN 3電子鼻，LC-20ADXR高效液相色譜儀。

2 方法

從湖北文理學(xué)院大一學(xué)生中共招募健康志愿者7名，其中男生3名，女生4名，年齡在18～20歲之間，BMI值在18.9～21.2之間，所有志愿者均為襄陽本地人，且近1個月內(nèi)未服用抗生素亦從未接受過腸道手術(shù)。取志愿者晨便用于乳酸菌的分離。

2.1 糞便樣品中乳酸菌的分離

取2.0 g糞便樣品，加入到含有10 mL無菌PBS緩沖液的離心管中，充分振蕩混勻后于4℃轉(zhuǎn)速為400 r/min離心10 min，上清液進(jìn)行10倍梯度稀釋，取梯度稀釋后-4，-5，-6三個梯度的菌懸液涂布于含有1.0%碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基中，37℃厭氧（85%N2，5%CO2及10%H2）培養(yǎng)48 h。挑選形態(tài)大小菌不相同且具有溶鈣圈的單菌落進(jìn)行編號，反復(fù)劃線于固體MRS平板上，對菌株進(jìn)行純化。將分離純化得到的乳酸菌菌懸液涂布于潔凈的載玻片上進(jìn)行革蘭氏染色和過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)，將革蘭氏陽性而過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)為陰性的菌株判定為疑似乳酸菌菌株。

2.2 疑似乳酸菌的鑒定

采用CTAB法（cetyltrimethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化銨）提取疑似乳酸菌菌株的基因組DNA[10]，參照文獻(xiàn)[11]中的擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化、連接、轉(zhuǎn)化和驗(yàn)證，挑取陽性克隆子寄往天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測序。將測序所得的16SrDNA序列與NCBI（National Center for Biotechnology Information，美國國立生物技術(shù)信息中心）網(wǎng)站中的Gen-Bank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對，運(yùn)用MEGA5.0的鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以確定分離菌株的分類學(xué)地位[12]。

2.3 發(fā)酵羊乳的制備

全脂羊乳粉、蔗糖和水按照質(zhì)量比11.5%、6.5%和82.0%的比例混合均勻，65℃水合30 min后進(jìn)行兩段均質(zhì)（一段20 MPa，二段4 MPa），95℃（5 min）水浴殺菌，冷卻至室溫后，按照5×106mL-1復(fù)原乳的比例分別接入乳酸菌菌懸液，并置于42℃培養(yǎng)箱中恒溫發(fā)酵24 h后4℃后熟24 h，備用。

2.4 發(fā)酵羊乳滋味品質(zhì)的評價

取50 g發(fā)酵羊乳加入150 mL蒸餾水，轉(zhuǎn)速為10 000 r/min(10 min)離心取上清，用吸管吸除上層脂肪，抽濾備用。參照沈馨的方法進(jìn)行發(fā)酵羊乳酸味、苦味、澀味、鮮味和咸味5基本味指標(biāo)及后味A（澀味的回味）、后味B（苦味的回味）和豐度（鮮味的回味）3個基本味的回味指標(biāo)測定[13]。每個樣品重復(fù)測定4次，取后3次數(shù)據(jù)取平均值用于數(shù)據(jù)分析。

除了下棋之外，積薪師父卻是一個靦腆內(nèi)斂的中年大叔。有一天，趁著李離與袁安不在，星雨悄悄問他：“師父你站在溪邊的窗外，真的沒有看清那位婆婆，還有神仙兒媳嗎？”

2.5 發(fā)酵羊乳中有機(jī)酸種類和含量的測定

參照田輝的方法進(jìn)行樣品前處理，并進(jìn)行適當(dāng)修改[14]。稱取2 g發(fā)酵羊乳與50μL的68%硝酸混合后，用濃度為0.01 mol/L磷酸二氫鉀流動相定容至10 mL，轉(zhuǎn)速為10 000 r/min離心10 min取上清。上清液121℃高溫處理15 min后，轉(zhuǎn)速為10 000 r/min（10 min）離心再次取上清液，過0.22μm濾膜備用。

參照楊成聰?shù)姆椒ㄟM(jìn)行有機(jī)酸測定，并進(jìn)行適當(dāng)修改[15]。定量有機(jī)酸種類為：乳酸、檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸和乙酸。流動相為濃度0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液；pH值為2.90；檢測波長為215 nm；色譜柱為Inertsil C18液相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；柱溫為30℃；流速為0.8 mL/min；進(jìn)樣量為20μL。

2.6 發(fā)酵羊乳風(fēng)味品質(zhì)的評價

取15 g發(fā)酵羊乳于電子鼻樣品瓶中，室溫平衡30 min，按照楊成聰?shù)姆椒ㄟM(jìn)行測試并做適當(dāng)修改[16]。設(shè)置參數(shù)：洗氣時間200 s；自動調(diào)零時間5 s；探頭插入時間5 s；樣品測定時間60 s，每間隔1 s測試一個數(shù)值；樣品間測試間隔1 min；進(jìn)樣流量120 mL/min；選取49～51 s內(nèi)各傳感器的響應(yīng)值作為原數(shù)數(shù)據(jù)求平均值后納入后續(xù)分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析

使用主成分分析法（principal component analysis，PCA）和多元方差分析法（multivariate analysis of variance，MANOVA）對乳桿菌和W.confusa（融合魏斯氏菌）制備發(fā)酵羊乳的差異性進(jìn)行分析；使用曼-惠特尼（Mann-Whiney）檢驗(yàn)對兩類發(fā)酵羊乳各滋味、有機(jī)酸和風(fēng)味指標(biāo)的差異性進(jìn)行分析。使用Origin 8.6軟件繪圖，使用SAS9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 青年人腸道源乳酸菌的分離鑒定

本研究從7名青年志愿者的糞便樣品中共分離純化出21株有溶鈣圈的菌株，且所有菌株革蘭氏染色均為陽性，過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)均為陰性，因而可以將其初步鑒定為疑似乳酸菌菌株[7]。分別提取21株菌株DNA，在對16SrDNA基因全長進(jìn)行擴(kuò)增的和測序的基礎(chǔ)上，將所得序列在GenBank中進(jìn)行相似性比對，同源性比對結(jié)果如表1所示。

由表1可知，21株疑似乳酸菌菌株與模式株參比序列同源性均在99%以上，菌株HBUAS54121、HBUAS54124、HBUAS54128、HBUAS54161、HBUAS54169和HBUAS54202被鑒定為Weissella confusa（融合魏斯氏 菌），菌 株 HBUAS54177、HBUAS54179和HBUAS54187被鑒定為Lactobacillus fermentum（發(fā)酵乳桿菌），菌株HBUAS54118和HBUAS54181被鑒定為Lactobacillus ruminis（瘤胃乳酸桿菌），菌株HBUAS54176、HBUAS54178和HBUAS54199被鑒定為Lactobacillus plantarum（植物乳桿菌），菌株HBUAS54183和HBUAS54186被鑒定為Lactobacillusreuteri（羅伊氏乳桿菌），菌株HBUAS54184和HBUAS54185被鑒定為Lactobacillus johnsonii（約氏乳桿菌），菌株HBUAS54111、HBUAS54131和HBUAS54145分別被鑒定為Lactobacillus agilis（敏捷乳桿菌）、Lactobacillus delbrueckii subsp.Delbrueckii（德氏乳桿菌德氏亞種）和Lactococcus garvieae（格氏乳球菌）。分離株與模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1。

表1 菌株16SrDNA序列同源性比對結(jié)果

圖1 乳酸菌16SrDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

由圖1可以看出，菌株HBUAS54118和HBUAS54181與模式菌株L.ruminis NBRC102161位于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一個分支上；菌株HBUAS54176、HBUAS54178和HBUAS54199與模式菌株L.plantarum NBRC15891位于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一個分支上；菌株HBUAS54184和HBUAS54185與模式菌株L.johnsonii ATCC33200位于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一個分支上；菌株HBUAS54183和HBUAS54186與模式菌株L.reuteri DSM 20016位于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一個分支上；菌株HBUAS54177、HBUAS54179和HBUAS54187與模式菌株L.fermentum CIP102980位于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一個分支上；菌株HBUAS54121、HBUAS54124、HBUAS54128、HBUAS54161、HBUAS54169和HBUAS54202與模式菌株W.confuse JCM 1093位于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一個分支上；菌 株 HBUAS54111、HBUAS54131和HBUAS54145分別與模式株 L.agilis DSM 20509、L.delbrueckii subsp.Delbrueckii BCRC12195和L.garvieae NIZO2415位于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一個分支上。本研究分離的21株乳酸菌共鑒定為2個屬和9個種，且W.confusa共有6株，占分離株的28.57%。由此可見，襄陽地區(qū)青年人腸道中乳酸菌類群多樣性較高，且以W.confusa為主。

3.2 青年人腸道源乳酸菌發(fā)酵羊乳滋味品質(zhì)的評價

在對青年人腸道中乳酸菌菌株進(jìn)行分離鑒定的基礎(chǔ)上，本研究選取可用于食品加工的部分L.fermentum、L.plantarum、L.reuteri和L.johnsonii菌株進(jìn)行了發(fā)酵羊乳制備，同時以W.confusa為對照，對青年人腸道源乳酸菌發(fā)酵羊乳的滋味品質(zhì)進(jìn)行了評價，其各滋味指標(biāo)相對強(qiáng)度的箱型圖如圖2所示。

圖2 發(fā)酵羊乳各滋味指標(biāo)相對強(qiáng)度的箱型

3.3 青年人腸道源乳酸菌發(fā)酵羊乳風(fēng)味品質(zhì)的評價

本研究進(jìn)一步采用電子鼻對發(fā)酵羊乳風(fēng)味品質(zhì)進(jìn)行了檢測與評價，各傳感器響應(yīng)值的差異性分析如表3所示。

由表3可知，傳感器W1C和W 3C對乳桿菌發(fā)酵羊乳的響應(yīng)值顯著高于W.confusa（P＜0.05）。由表2亦可知，傳感器W1C和W3C主要對芳香類物質(zhì)靈敏，因而乳桿菌發(fā)酵羊乳的風(fēng)味品質(zhì)優(yōu)于W.confusa。值得一提的是，傳感器W 1S，W 2S，W3S，W5S，W6S，W1W，W 2W和W 5C對兩類乳酸菌發(fā)酵羊乳的響應(yīng)值差異均不顯著（P＞0.05）。

3.4 乳酸菌發(fā)酵羊乳產(chǎn)品品質(zhì)評價

本研究基于多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對青年人腸道源乳酸菌發(fā)酵羊乳產(chǎn)品品質(zhì)評價：進(jìn)一步結(jié)合電子舌和電子鼻數(shù)據(jù)使用PCA（主成分分析法）對其進(jìn)行了評價和分析，經(jīng)PCA發(fā)現(xiàn)，前4個主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為88.42%，且前6個主成分的特征值均大于1。根據(jù)主成分個數(shù)確定的原則，若某一主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率大于85.0%且其特征值大于1.0，則將其定義為主成分[17]，因而本研究選取了4個主成分，其中第一主成 分（Principal Component1，PC1）的 貢 獻(xiàn) 率 為52.94%，PC2的貢獻(xiàn)率為15.63%，PC3的貢獻(xiàn)率為12.24%，PC4的貢獻(xiàn)率為7.61%?；赑CA發(fā)酵羊乳主成分分析的因子得分如圖3所示。

由圖3可以看出，PC1主要由風(fēng)味指標(biāo)構(gòu)成，包括W1C，W3C，W5C，W1S，W2S，W5S，W6S，W1W和W2W；而PC2主要由滋味指標(biāo)構(gòu)成，包括酸味、鮮味、豐度（鮮味的回味）和后味A（澀味的回味）?；赑CA發(fā)酵羊乳滋味品質(zhì)的PC1與PC2因子載荷圖如圖4所示。

由圖4可以看出，乳桿菌和W.confusa制備的發(fā)酵羊乳樣品在空間排布上呈現(xiàn)出明顯的分離趨勢，這說明兩類發(fā)酵羊乳的品質(zhì)存在較大的差異，且經(jīng)MANOVA發(fā)現(xiàn)差異顯著（P＜0.05）。由圖5可以看出，由L.fermentum HBUAS54187，L.plantarum HBUAS54176和L.johnsonii HBUAS54185制備的發(fā)酵羊乳均分布在第三象限；電子鼻傳感器W 1C，W 3C和W 5C對其響應(yīng)值明顯偏高且酸味濃郁，具有良好的滋味和風(fēng)味品質(zhì)。由此可見，上述3株乳桿菌可作為潛在菌株，用于后續(xù)具有良好羊乳發(fā)酵特性乳酸菌的篩選。

表3 各傳感器對發(fā)酵羊乳響應(yīng)值差異分析

圖3 發(fā)酵羊乳滋味品質(zhì)PC1與PC2因子載荷圖

圖4 發(fā)酵羊乳滋味品質(zhì)PC1與PC2因子得分圖

4 結(jié)論

本文對襄陽地區(qū)青年人腸道中乳酸菌分離及在發(fā)酵羊乳中的應(yīng)用進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：從糞便樣品中共分離出21株疑似乳酸菌菌株，共鑒定為2個屬和9個種，且W.confusa占分離株的28.57%。通過電子舌分析發(fā)現(xiàn)，由乳桿菌和W.confusa制備的發(fā)酵羊乳各滋味指標(biāo)差異不顯著（P＞0.05）。通過電子鼻分析發(fā)現(xiàn)，傳感器W 1C和W3C對乳桿菌發(fā)酵羊乳的響應(yīng)值顯著高于W.confusa（P＜0.05）。通過主成分分析和多元方差分析發(fā)現(xiàn)，乳桿菌和W.confusa制備的發(fā)酵羊乳品質(zhì)存在顯著的差異（P＜0.05）。由此可見，W.confusa為襄陽地區(qū)青年人腸道中的優(yōu)勢乳酸菌，較之W.confusa乳桿菌制備的發(fā)酵羊乳具有更佳的品質(zhì)。