張亞川，蔡靜靜，剡文莉，王麗軍，倪永清

（石河子大學(xué)食品學(xué)院食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子832000）

0 引言

伊犁州是我國重點(diǎn)牧區(qū)之一[1]。當(dāng)?shù)鼐用裰谱鞯膫鹘y(tǒng)乳制品中蘊(yùn)藏著豐富的乳酸菌資源。許多學(xué)者對新疆傳統(tǒng)乳制品中的乳酸菌進(jìn)行了研究，董曉婉等[2]從新疆和布克賽爾縣25份傳統(tǒng)酸乳中分離出40株乳酸菌。劉潔潔等[3]從阿勒泰地區(qū)傳統(tǒng)乳制品中分離出11株乳酸菌。馬燕等[4]從伊犁、石河子地區(qū)分離出104株乳酸菌。

傳統(tǒng)的乳酸菌鑒定方法依賴于表型分析[5]。16S rDNA是細(xì)菌分類研究中最常用的分子鐘[6]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使用16SrRNA序列分析方法鑒定LAB越來越普遍。

我國不同區(qū)域的自然發(fā)酵乳品承載了當(dāng)?shù)刎S富的微生物資源，因此應(yīng)深入研究并從中篩選出優(yōu)良乳酸菌用于工業(yè)化生產(chǎn)[7]。伊犁地區(qū)傳統(tǒng)乳制品中微生物數(shù)量眾多，對其中優(yōu)良發(fā)酵菌株的開發(fā)能夠?yàn)樗崛榘l(fā)酵劑的制作提供菌株。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料及試劑

（1）實(shí)驗(yàn)樣品。采自新疆伊犁地區(qū)的傳統(tǒng)奶制品。

（2）培養(yǎng)基。MRS肉湯培養(yǎng)基，用于乳桿菌的富集；MRS固體培養(yǎng)基（MRS肉湯添加1.7%的瓊脂），用于乳桿菌的分離篩選；M 17肉湯培養(yǎng)基，用于乳球菌的富集；M 17固體培養(yǎng)基（M 17肉湯添加1.7%的瓊脂），用于乳球菌的分離篩選。上述培養(yǎng)基121℃滅菌15 min使用。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%脫脂乳培養(yǎng)基，95℃滅菌5 min使用。

（3）試劑。Easy Pure Bacteria Genomic DNA Kit，PCR擴(kuò)增體系所需試劑以及擴(kuò)增引物。

1.2 儀器

恒溫生化培養(yǎng)箱，PCR儀，水平電泳儀為，電泳槽，凝膠成像系統(tǒng)等。

2 方法

2.1 乳酸菌的分離鑒定

2.1.1 乳酸菌的分離純化

樣品用無菌生理鹽水稀釋至10-4，10-5，10-6；吸取100 L稀釋后的樣品均勻的涂布在MRS、M 17培養(yǎng)基上[8]。觀察菌落顏色、大小、凸起程度和光澤度，挑選其中具有乳酸菌典型特征的單菌落進(jìn)行富集。取適量菌懸液進(jìn)行鏡檢，若鏡檢中菌株細(xì)胞形態(tài)、排列方式不一致，則需繼續(xù)劃線純化至一致。純化后的菌株37℃條件下培養(yǎng)18 h后進(jìn)行革蘭氏染色。將革蘭氏陽性菌株富集后以2%的接種量接種到12%的滅菌脫脂乳中37℃培養(yǎng)，具備凝乳特性的菌株保藏至-80℃?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 生理生化實(shí)驗(yàn)

參照“東秀珠”等《常見細(xì)菌鑒系統(tǒng)定手冊》[9]。

2.1.3 乳酸菌16SrRNA序列分析

（1）菌株DNA的提取。菌體DNA的提取采用Easy Pure Bacteria Genomic DNA Kit試劑盒，使用試劑盒所提供的藥品按照說明書步驟提取DNA。

（2）16S rRNA序列擴(kuò)增。擴(kuò)增引物采用乳酸菌通用引物，上游引物27F：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，下游引物1492R：5′-TAC CTT GTT ACG ACT T-3′。

PCR擴(kuò)增體系（25 L體系）：預(yù)混液2×Taq MasterMix 12.5 L，引物27F 0.5 L，引物1492R 0.5 L，DNA模板2 L，補(bǔ)充ddH2O至25 L。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，57℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸7 min；4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，100 V電泳40 min，凝膠成像儀下采集圖像。

（4）系統(tǒng)發(fā)育分析。菌株16S rRNA序列擴(kuò)增成功后，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST在線分析。將測序菌株以及模式菌株的16SrRNA序列經(jīng)Clustal X多重比對后，運(yùn)用MEGA 6.0軟件對各菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位進(jìn)行分析。

2.2 發(fā)酵菌種的篩選

2.2.1 凝乳時(shí)間的確定

將37℃條件下培養(yǎng)18 h的乳酸菌在轉(zhuǎn)速為4 000 r/min下離心10 min后，棄去上清液并用滅菌生理鹽水洗滌，反復(fù)洗滌3次后用生理鹽水將離心菌體重懸。以2%的接種量將菌種接種于滅菌脫脂乳中，置于37℃恒溫培養(yǎng)至其凝乳，保存至4℃冰箱作為發(fā)酵劑備用[10]（以下實(shí)驗(yàn)所用酸奶發(fā)酵劑均按此方法制備）。將單菌株發(fā)酵劑以2%的添加量接種于滅菌脫脂乳中，置于37℃下恒溫培養(yǎng)，每隔1 h檢查凝乳狀況，待樣品凝乳后記錄凝乳時(shí)間，并將酸乳置于4℃冷藏柜保藏待用。

2.2.2 酸度測定

取5.0 g冷藏的發(fā)酵乳樣品于100 mL錐形瓶中，加入40 mL煮沸蒸餾水混合均勻，并加入5滴0.5%的酚酞指示劑，用0.1 mol/L的標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定至粉紅色，1 min內(nèi)不變色。記錄氫氧化鈉的消耗量及酸乳的質(zhì)量[11]，其計(jì)算公式為

式中：X1為試樣的酸度；C1為氫氧化鈉濃度；V1為樣品消耗氫氧化鈉體積；V0為空白消耗氫氧化鈉體積；100為100 g試樣；M1為試樣的質(zhì)量；0.1為酸度理論定義氫氧化鈉的濃度。

2.2.3 感官評定

邀請10名食品專業(yè)的研究生對冷藏24 h的發(fā)酵乳從色澤、風(fēng)味、組織狀態(tài)方面進(jìn)行感官特性評價(jià)，各項(xiàng)總分為色澤10分、風(fēng)味40分、組織狀態(tài)50分。取出冷藏酸乳觀察其組織狀態(tài)和色澤，再聞其氣味，用純凈水漱口后，品嘗樣品的滋味，并記錄對應(yīng)項(xiàng)得分。

2.3 菌株產(chǎn)酸性能

2.3.1 生長性能

采用比濁法測定菌株的生長曲線?；罨蟮木暌?%的接種量接種于裝有150 mL液體MRS培養(yǎng)基的200 mL錐形瓶中，37℃條件下培養(yǎng)30 h，每隔2 h測其OD600值。繪制OD600值與培養(yǎng)時(shí)間的曲線[12]。

2.3.2 菌株產(chǎn)酸能力

單菌株發(fā)酵劑以2%的接種量接種于脫脂乳中，37℃恒溫培養(yǎng)，每隔2 h取出樣品測其滴定酸度，直至滴定酸度趨于穩(wěn)定。繪制酸乳發(fā)酵過程中酸度隨時(shí)間變化的曲線。酸度測定方法以及發(fā)酵劑制備方法見上述。

2.3.3 菌株后酸化能力

單菌株發(fā)酵劑以2%的接種量接種于滅菌脫脂乳中，發(fā)酵至終點(diǎn)后將發(fā)酵乳取出置于4℃保藏，分別于第1，5，10，15，20 d取出測其滴定酸度。酸度測定方法以及發(fā)酵劑制備方法見上述。

3 結(jié)果與討論

3.1 乳酸菌的分離鑒定

3.1.1 乳酸菌的分離純化

從采集的酸牛乳、酸駝乳以及奶酪中初步分離出具有明顯乳酸菌特征的菌株71株，其中具有產(chǎn)酸凝乳特性的乳酸菌8株，8株乳酸菌的顯微鏡檢圖片以及菌體形態(tài)特征如圖1和表1所示。

圖1 乳酸菌顯微特征

表1 菌落形態(tài)以及菌株形態(tài)表征

3.1.2 生理生化實(shí)驗(yàn)

8株乳酸菌的生理生化結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，8株乳酸菌接觸酶實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、硫化氫實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均為陰性。糖醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，所有菌株均能利用葡萄糖和乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸；果糖實(shí)驗(yàn)中，只有菌株BLK7-10和BLK7-12呈 陰 性；菌 株 BLK7-10，BLK7-12，XKN 1-5，BST 4-1可以利用蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸；菌株BLK7-10，XKN 1-5，BST4-1可以利用麥芽糖發(fā)酵產(chǎn)酸；阿拉伯糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，只有菌株BLK7-10呈陽性。菌 株BLK7-10，BST 4-1，BST 2-3，BSTS6-1，BSTS6-3，BSTS6-4與乳桿菌的特征相似，初步判斷上述6株菌為乳桿菌。菌株XKN 1-5和BLK7-12與乳球菌的特征相似，初步判斷菌株XKN 1-5和BLK7-12為乳球菌。

表2 生理生化鑒定

圖2 PCR產(chǎn)物凝泳膠電圖

3.1.3 16SrRNA序列分析

所篩選菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物如圖2所示。由圖2可以看出，所有菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均在1 500 pb左右出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶，與預(yù)期大小相符，說明擴(kuò)增成功。將8株菌的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物科技有限公司完成相關(guān)測序工作。

3.1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

將8株乳酸菌的部分16SrRNA基因序列將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST在線分析，比對結(jié)果如表3所示。選取同源性最高的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示，由圖3可以看出，7株乳酸菌屬于Lactobacillus，Leuconostoc，Enterococcus三個(gè)屬；其中菌株BSTS6-1，BSTS6-3，BSTS6-4與Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus 57-1，Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus 9-4，Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus YLj15在一個(gè)分支上，且相似度達(dá)到99%，可確定3株菌為德氏乳桿菌保加利亞亞種；菌株BLK7-10與Lactobacillus kefiranofaciens KF16在一個(gè)分支上；菌株BLK7-12與Enterococcus faecalis G1在同一分支上，且相似度高達(dá)99%，判定菌株BLK7-12為糞腸球菌；菌株XKN 1-5與Leuconostoc lactis MYSN 98在同一個(gè)分支上，相似度達(dá)99%，判定菌株XKN 1-5為乳酸明串球菌；菌株BST4-1、BST2-3分別于Lactobacillus plantarum AS-6、Lactobacillus fermentum LDTM在同一分支上，相似度均達(dá)100%，判定兩株菌分別為植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌。

3.2 發(fā)酵劑菌種的篩選

（1）發(fā)酵時(shí)間。在酸乳生產(chǎn)過程中，如果凝乳時(shí)間太短，不利于酸乳香味的生成，也會(huì)對酸乳的組織狀態(tài)產(chǎn)生影響。凝乳時(shí)間過長，雖然對狀態(tài)和香味有一定作用，但不利于節(jié)約生產(chǎn)能源和時(shí)間，也易造成發(fā)酵過程中的雜菌污染[13]。由表4可以看出，大部分乳酸菌的凝乳時(shí)間在17 h以下，菌株BST4-1發(fā)酵時(shí)間為32 h，發(fā)酵時(shí)間過長，不滿足發(fā)酵需求。

（2）滴定酸度。由表4可以看出，8株乳酸菌的滴定酸度均在60～90°T，GB19302-2010規(guī)定酸乳酸度應(yīng)大于70°T[14]，但是由于后期要進(jìn)行菌株復(fù)合發(fā)酵，故酸度滿足生產(chǎn)要求。

（3）感官評價(jià)。由8株乳酸菌發(fā)酵制成的酸乳色澤較為良好，均呈現(xiàn)乳白色或微黃色，其中菌株BSTS6-4的色澤最好；菌株BSTS6-1，BSTS6-3，BSTS6-4，XKN 1-5均具有酸牛奶特有的風(fēng)味且無苦澀味；菌株BLK7-12，BLK7-10，BST2-3雖然有酸牛奶特有的風(fēng)味但由略微的澀味；菌株BSTS6-1，BSTS6-3，BSTS6-4發(fā)酵制得的酸乳質(zhì)地細(xì)膩、表面光滑、無裂縫；菌株BLK7-10，BST 2-3，XKN 1-5發(fā)酵制得的酸乳有輕微的乳清析出。菌株BLK7-12制得的酸乳有乳清析出且分層，凝乳狀態(tài)差，不滿足需求。

圖3 菌株16SrRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

表3 菌株系統(tǒng)發(fā)育相似性分析

表4 發(fā)酵菌種篩選結(jié)果

3.3 菌株產(chǎn)酸性能研究

3.3.1 菌株生長曲線

由圖4可以看出，大部分菌株在培養(yǎng)4 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，18 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期。菌株BLK7-10培養(yǎng)至24 h后才有緩慢生長，生長周期過長，不符合工業(yè)生產(chǎn)需求。除菌株BLK7-10外，其他5株乳酸菌在培養(yǎng)18 h后菌懸液OD 600值均能達(dá)到1.3以上，生長性能 良 好，菌 株 BSTS6-1，BSTS6-3，BSTS6-4，XKN 1-5，BST2-3的最佳收獲時(shí)間為18～20 h。

3.3.2 菌株產(chǎn)酸能力

菌株產(chǎn)酸速率是評價(jià)酸乳發(fā)酵劑的一項(xiàng)重要指標(biāo)，快速的酸化不僅對成品的香氣、質(zhì)構(gòu)和感官特性有重要影響，也能有效防止酸乳污染[15]。由圖5可以看出，菌株XKN 1-5產(chǎn)酸速率最快，20 h內(nèi)酸度可達(dá)到112.86°T，菌株BSTS6-4在20 h內(nèi)酸度由24.44°T上升到99.48°T，產(chǎn)酸速率較快。菌株BSTS6-1在20 h內(nèi)，酸度由27.29°T上升到94.31°T，菌株BSTS6-3在20 h酸度由28.51°T上升至97.65°T。菌株BST2-3和BLK7-10產(chǎn)酸速率較慢，實(shí)際生產(chǎn)中易造成酸乳污染，產(chǎn)生不必要的經(jīng)濟(jì)損失。

圖4 菌體密度變化曲線（OD600值）

圖5 發(fā)酵過程中乳酸菌酸度的變化

3.3.3 菌株后酸化能力

后酸化使得酸乳在冷藏過程中過酸甚至產(chǎn)生苦味，不僅會(huì)產(chǎn)生讓消費(fèi)者難以接受的風(fēng)味，也會(huì)降低產(chǎn)品的貨架期。酸乳生產(chǎn)中常使用后酸化能力較弱的菌株來降低后酸化對酸乳的影響[16]。由圖6可以看出，8株乳酸菌在20 d冷藏過程中酸度均有所升高，其中菌株XKN 1-5酸度變化最大，冷藏過程中酸度增加了24.18°T，后酸化能力較強(qiáng)，可能會(huì)造成酸乳風(fēng)味的改變以及貨架期的降低；菌株BLK7-10在冷藏過程中酸度增加了3.9°T，酸度變化最小，這可能與其自身產(chǎn)酸速率較低有關(guān)；菌株BSTS6-1，BSTS6-3，BSTS6-4，BST 2-3在冷藏過程中酸度增加量較為適度，不會(huì)對酸乳的品質(zhì)造成影響。

圖6 冷藏過程中酸乳酸度的變化

4 結(jié)論

從新疆伊犁地區(qū)采集的乳品中共分離出8株具有產(chǎn)酸凝乳性能的乳酸菌，其中菌株BSTS6-4，BSTS6-3，BSTS6-1為德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp.b Lugaricus），菌株BLK7-10為開 菲 爾 乳 桿 菌（Lactobacillus kefiranofaciens），菌 株XKN 1-5為乳酸明串球菌（Leuconostoc lactis），菌株BLK7-12為 糞 腸 球 菌（Enterococcus faecalis），菌 株BST 2-3為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum），菌株BST 4-1為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。經(jīng)過初篩得到6株凝乳時(shí)間短，酸乳組織狀態(tài)良好、風(fēng)味較佳的乳酸菌。通過對6株乳酸菌的生長性能、產(chǎn)酸性能進(jìn)行分析對比，得到4株生長速度快、菌懸液濃度高、產(chǎn)酸速率高的乳酸菌XKN 1-5，BSTS6-1，BSTS6-3，BSTS6-4。后酸化實(shí)驗(yàn)表明，菌株XKN 1-5在冷藏過程中酸度變化較大，可能會(huì)造成酸乳在冷藏過程中的酸敗變質(zhì)，不利于酸乳的后期儲(chǔ)存，不符合工業(yè)生產(chǎn)需求。菌株BSTS6-1，BSTS6-3，BSTS6-4后酸化能力較弱，在冷藏過程中酸度變化較小，因此菌株BSTS6-1，BSTS6-3，BSTS6-4將作為備選菌株應(yīng)用到后期的復(fù)合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。