湯超，劉立聰，陳雄，代俊，李欣，姚娟，鄭國斌，王志*

1(發(fā)酵工程教育部重點實驗室，湖北省食品發(fā)酵工程技術研究中心，工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，工業(yè)微生物湖北省重點實驗室，湖北工業(yè)大學，湖北 武漢，430068)2(湖北省酵母功能重點實驗室，安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌，443003)

酵母抽提物富含多肽、氨基酸、呈味核苷酸、VB族及微量元素，具有純天然、營養(yǎng)豐富、味道醇厚等諸多優(yōu)點[1-2]，在各類食品、保健品、調(diào)味品生產(chǎn)過程中應用廣泛[3]，但其鮮度不夠突出(主要是谷氨酸含量偏低)[4-5]。

作為TCA循環(huán)中重要的中間產(chǎn)物，檸檬酸還是調(diào)控中心碳代謝途徑的效應物之一[12]，具有調(diào)控EMP途徑磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶活性的功能[13-14]，可以降低EMP途徑丙酮酸節(jié)點的碳溢流，減少或抑制乙醇、有機酸等溢流產(chǎn)物的合成[15-17]。而目前基于降低Crabtree效應(以乙醇合成效率降低為特征和指標)來提高釀酒酵母胞內(nèi)谷氨酸含量的策略還未見報道。

為提高釀酒酵母的生物量和胞內(nèi)谷氨酸含量，本文優(yōu)化了檸檬酸鈉-糖蜜補料策略，研究了其對釀酒酵母代謝及胞內(nèi)谷氨酸合成積累的影響，為富谷氨酸酵母工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)J-5，由安琪酵母股份有限公司提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖50，酵母浸粉20，MgSO4·7H2O 1，KH2PO41，pH 4.8～5.0，115 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基(YS培養(yǎng)基) (g/L)：蔗糖100，酵母浸粉20，MgSO4·7H2O 1，KH2PO41，pH 4.9，250 mL三角瓶裝液量100 mL，115 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：糖蜜(含總糖質(zhì)量分數(shù)35.8%)100 mL/L、酵母浸粉 10 g/L、工業(yè)蛋白胨 20 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、KH2PO40.5 g/L、FeSO4·7H2O 2 g/L，115 ℃滅菌20 min。

補料培養(yǎng)基：糖蜜和檸檬酸鈉混合液。

1.1.3 儀器

高壓滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；DZF-6020電熱鼓風干燥箱，重慶銀河實驗儀器有限公司；SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；電子分析天平，北京賽多利斯天平有限公司；TG18M臺式高速離心機，長沙平凡儀器儀表有限公司；HNY-211B恒溫搖床，天津市歐諾儀器儀表有限公司；CJ-1D潔凈工作臺，天津市泰斯特儀器有限公司；容聲BCD-560WD11HY冰箱，海信容聲冰箱有限公司；pH計，賽默飛世爾科技有限公司；高效液相色譜U3000，安捷倫公司；10 L發(fā)酵罐，上海保興生物工程設備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子培養(yǎng)方法

將斜面菌種用接種環(huán)勾出一環(huán)在新鮮斜面培養(yǎng)基上劃滿整個表面，30 ℃培養(yǎng)12 h；再向培養(yǎng)好的斜面中每支倒入15 mL無菌水洗脫表面菌體，并用移液槍吹打均勻成菌懸液，然后轉接至搖瓶，每瓶接種量為10%(5 mL菌懸液)，放置搖床180 r/min，30 ℃培養(yǎng)10 h。

1.2.2 發(fā)酵控制

10 L發(fā)酵罐控制：制備5 L搖瓶種子液，種子液合瓶后于4 ℃靜置8 h，后棄上清液，濃縮的合瓶種子液體積約1 L，接入10 L發(fā)酵罐(定容5 L發(fā)酵培養(yǎng)基)，接種后混合體系體積為6 L。發(fā)酵溫度30 ℃，用10%(質(zhì)量分數(shù))H2SO4和濃氨水控制pH在5.3左右。

1.2.3 流加補料策略

補料1：糖蜜流加補料發(fā)酵，第3～14 h流加糖蜜，初始流速50 mL/h，隨后每2 h增加補料速率，增加梯度為30 mL/h。如：第5～7 h為80 mL/h，第7～9 h為110 mL/h等，總量為1 300 mL，糖蜜含總糖質(zhì)量分數(shù)為35.8%。

補料2：糖蜜-檸檬酸鈉流加補料發(fā)酵，程序同補料1，糖蜜中混入48 g檸檬酸鈉。

補料3：第3～14 h流加糖蜜，初始流速50 mL/h，隨后每2 h增加補料速率，增加梯度為50 mL/h，總量為1 800 mL，糖蜜中混合48 g檸檬酸鈉。

補料4：優(yōu)化后的糖蜜-檸檬酸鈉流加補料發(fā)酵，補料程序同補料3，糖蜜中混入72 g檸檬酸鈉。

1.2.4 酵母胞內(nèi)谷氨酸測定

樣品預處理：取發(fā)酵培養(yǎng)24 h后的發(fā)酵液2.5 mL，6 500 r/min離心5 min,倒掉上清,水洗菌體2次，再用5 mL去離子水重懸菌體，-20 ℃凍1.5 h，80 ℃水浴15 min，反復凍融4次。凍融好的菌懸液6 500 r/min離心5 min,取上清600 μL于2 mL離心管再向其中加入2倍體積(1.2 mL)冰凍后的無水乙醇，10 000 r/min，4 ℃離心5 min，0.22 μm的濾頭過濾上清于樣品瓶，-20 ℃保存。胞內(nèi)游離谷氨酸含量采用HPLC檢測[5,18-19]。

HPLC分析條件：色譜柱為安捷倫ZORBAX SB-Aq column(150 mm×4.6 mm×5 μm)，Aglient USA；柱溫30 ℃；進樣量20 μL；紫外檢測波長210 nm；采用10 mol/L pH 1.8的K2HPO4(磷酸調(diào)pH)作為流動相；流速0.6 mL/min。根據(jù)所測標品，谷氨酸的保留時間為4.6 min。胞內(nèi)谷氨酸含量計算如公式(1)：

(1)

1.2.5 菌體干重測定

取發(fā)酵液7 mL，6 500 r/min離心5 min，倒掉上清水洗菌體2次，80 ℃烘箱連續(xù)烘干24 h，取出放入干燥器冷卻后稱質(zhì)量，得到細胞干重(g/L)。

1.2.6 總糖測定方法

總糖質(zhì)量濃度測定采用硫酸蒽酮法[20]。

1.2.7 乙醇測定方法

乙醇質(zhì)量濃度通過生物分析傳感儀測定[21]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗數(shù)據(jù)至少3個平行試驗，采用Origin 8.5對試驗數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 檸檬酸鈉對釀酒酵母搖瓶發(fā)酵合成谷氨酸的影響

由圖1可知，搖瓶中菌體干重約在8.8 g/L，檸檬酸鈉未對釀酒酵母生物量產(chǎn)生顯著影響。但是，隨著檸檬酸鈉濃度的增加，胞內(nèi)谷氨酸含量呈先升后降的趨勢，檸檬酸質(zhì)量濃度為2 g/L時含量胞內(nèi)谷氨酸質(zhì)量分數(shù)達到峰值(2.96%)，比對照組(2.55%)提高了16.1%，因此選擇2 g/L為最適添加量。

圖1 檸檬酸鈉對釀酒酵母生物量和胞內(nèi)谷氨酸的影響Fig.1 Effects of sodium citrate addition on biomass andglutamate production in Saccharomyces cerevisiae J-5

2.2 補料策略1對酵母產(chǎn)胞內(nèi)谷氨酸合成的影響

根據(jù)補料1的設置，在3～14 h流加1 300 mL糖蜜，酵母胞內(nèi)谷氨酸、菌體生長代謝的影響如圖2。補料期間總糖含量在2.5～10 g/L，細胞以近線性狀態(tài)增長至12 h(細胞干重為28.08 g/L，平均比生長速率接近0.069 h-1)。3～14 h補糖過程中，經(jīng)丙酮酸溢流合成的乙醇質(zhì)量濃度由16 g/L緩慢升至22 g/L，而胞內(nèi)谷氨酸質(zhì)量分數(shù)則在1.5%波動。說明補料期間細胞發(fā)生了Crabtree效應(乙醇溢流)[23]。雖然酵母適應于溢流代謝(乙醇發(fā)酵)而快速生長，但TCA循環(huán)的碳流量下調(diào)與增強TCA中間產(chǎn)物α-酮戊二酸前體供量、促進谷氨酸合成的發(fā)酵目標相矛盾，使得谷氨酸的合成和積累處于低水平的平衡狀態(tài)中。

圖2 10 L罐補料策略1對釀酒酵母J-5發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of feeding strategy 1 on the fermentation ofSaccharomyces cerevisiae J-5 in a 10 L bioreactor

補糖結束后，總糖由12 h的8.73 g/L被快速利用至15 h的6.11 g/L，后維持在5 g/L左右，而乙醇由12 h的18 g/L被快速利用至21 h的1.0 g/L，說明12～21 h隨著還原糖的利用，Crabtree效應減弱或消失，乙醇作為儲備碳源經(jīng)乙酰CoA回補TCA循環(huán)和乙醛酸循環(huán)[22]，維持了細胞的近線性的二次生長，其平均比生長速率約為0.019 h-1，僅為1次生長期間的27.5%，細胞干重在21 h達到36.36 g/L。

雖然細胞以乙醇為碳源的生長效率低于利用糖蜜的，但由于Crabtree效應減弱或解除，TCA循環(huán)的碳通量增大促進了胞內(nèi)谷氨酸的積累[23]，并在18 h達到峰值(2.28%)。另外，在以乙醇為主要碳源進行二次生長期間，由于其比生長速率相比于一次生長期間大幅度下降，細胞對谷氨酸“氮庫中轉”的生理需求[11]降低，“谷氨酸合成加速和中轉需求降低”是胞內(nèi)谷氨酸積累的主要原因。而18 h后被降解利用，這可能與18 h以后碳源不足、谷氨酸做碳源在GDH2催化下回補TCA循環(huán)[5]，以滿足細胞生長的需要有關。

0～12 h發(fā)酵體系內(nèi)碳源充足，EMP途徑通量大，遠高于TCA循環(huán)通量，Crabtree效應使得谷氨酸的合成和積累處于低水平的平衡狀態(tài)中，因此，發(fā)酵過程中要適度抑制EMP途徑碳代謝流量，避免中間產(chǎn)物(丙酮酸)過剩造成碳源溢流。由于檸檬酸能顯著地降低磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶活性，因而能適當?shù)販p緩EMP途徑的代謝流量[15-17]。因此，需要考慮補料與檸檬酸鈉的綜合作用對谷氨酸、菌體生長代謝的影響。

2.3 補料策略2對酵母產(chǎn)胞內(nèi)谷氨酸發(fā)酵過程的影響

根據(jù)補料1的生長特點，峰值細胞干重達到了36.36 g/L，是搖瓶發(fā)酵的4.13倍。由于檸檬酸鈉調(diào)控代謝的對象是單個細胞，因此，按細胞干重比例調(diào)整檸檬酸鈉終質(zhì)量濃度為8 g/L(48 g檸檬酸鈉)，形成補料2策略。該補料模式對酵母產(chǎn)胞內(nèi)谷氨酸、菌體生長和主要代謝的影響如圖3。

圖3 10 L罐補料策略2對釀酒酵母J-5發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of feeding strategy 2 on the fermentation ofSaccharomyces cerevisiae J-5 in 10 L bioreactor

由圖3可知，3～14 h酵母生物量近線性生長到14 h(34.56 g/L)，平均比生長速率約0.069 h-1，與補料策略1(0.069 h-1)相同，說明添加的檸檬酸鈉對細胞的生長未產(chǎn)生負面影響。0～3 h溢流分子(乙醇)大量積累維持在17 g/L左右，與圖2(18 g/L)接近。但是，補料期間(3～14 h)，乙醇持續(xù)下降到10 g/L。這說明檸檬酸鈉的調(diào)控作用使丙酮酸溢流生成乙醇的效率降低，并轉化乙醇為乙酰CoA進入TCA循環(huán)乙醛酸循環(huán)[24]。期間，谷氨酸合成效率>生長的“氮庫中轉需求”而在細胞內(nèi)積累，持續(xù)從3 h的1.67%(質(zhì)量分數(shù))上升到12 h的2.93%(質(zhì)量分數(shù))，比補料策略1谷氨酸峰值濃度提高近29%。

補料結束后(14～21 h)，細胞進入穩(wěn)定期。而乙醇仍在被迅速利用，由14 h的10 g/L降至21 h的2 g/L。而胞內(nèi)谷氨酸也在緩慢地被“中轉”轉化(21 h其質(zhì)量分數(shù)降至2.38%)。對比補料策略1(圖2)說明在策略2條件下，發(fā)酵后期碳源不足(乙醇質(zhì)量濃度僅為10 g/L，是圖2的55.6%)，其代謝產(chǎn)生的中間產(chǎn)物和能量不足以維持高細胞濃度條件的生理需求，細胞開始利用胞內(nèi)的游離谷氨酸，因此胞內(nèi)含量下降是必然結果。

但補料期間的谷氨酸峰值比補料策略1(18 h，質(zhì)量分數(shù)2.28%)高出了29%。這一現(xiàn)象說明了添加檸檬酸鈉有效地減緩了EMP途徑生成丙酮酸的速率，通過減少乙醇溢流途徑，來增大TCA循環(huán)的通量，提高了α-酮戊二酸的供給，促進了谷氨酸的合成效率。另外，可以考慮增加糖蜜的補料量以增加碳源的供應。

2.4 補料策略3對酵母產(chǎn)胞內(nèi)谷氨酸發(fā)酵過程的影響

基于2.3中的分析，在策略2的基礎上提高補料組分中糖蜜的量(檸檬酸鈉量不變)形成補料策略3，該補料模式對酵母產(chǎn)胞內(nèi)谷氨酸、菌體生長和主要代謝的影響如圖4。

圖4 10 L罐補料策3對釀酒酵母J-5發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of feeding strategy 3 on the fermentation ofSaccharomyces cerevisiae J-5 in 10 L bioreactor

由圖4中可知，補料期間平均比生長速率為約0.076 h-1，較策略2(0.069 h-1)提高了9%，14 h時干重達35.6 g/L，這說明同階段增加補糖可以提高比生長速率。乙醇質(zhì)量濃度在3～8 h處于下降趨勢，在8 h降到補料期最低點(10 g/L)后逐漸升高至14 h的19 g/L，說明8～14 h發(fā)生了二次溢流現(xiàn)象。增加糖的供應后，檸檬酸鈉的調(diào)控作用不足以緩解此條件下EMP途徑生成丙酮酸的速度，致使乙醇溢流途徑加強，乙醇溢流途徑增強會減少TCA循環(huán)的通量[25-26]，這種情況對于谷氨酸合成是不利的，需要考慮繼續(xù)增加檸檬酸鈉的添加量。但即使如此，谷氨酸質(zhì)量分數(shù)在10 h也達到了峰值(3.54%)，進一步比策略2提高了20.8%。隨后因乙醇溢流而減弱了TCA循環(huán)的碳流，導致谷氨酸合成效率降低。而細胞仍保持著高比生長速率生長，對谷氨酸的“氮庫中轉”需求旺盛，致使谷氨酸質(zhì)量分數(shù)持續(xù)下降到14 h(3.03%)。補料結束時，二次溢流使乙醇積累至 14 h 的19 g/L，14～18 h細胞二次生長的主要碳源和能源是乙醇，期間乙醇的利用效率是1.4 g/(L·h)，平均二次生長速率約為0.018 h-1，僅為補料期間的23.9%，但與補料策略1接近(圖2)。

2.5 補料策略4對酵母產(chǎn)胞內(nèi)谷氨酸發(fā)酵過程的影響

基于2.4的分析，在策略3的基礎上提高補料組分中的檸檬酸鈉至72 g，形成補料策略4，該補料模式對酵母產(chǎn)胞內(nèi)谷氨酸、菌體生長代謝的影響如圖5。

圖5 10 L罐補料策略4對釀酒酵母J-5發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of feeding strategy 4 on the fermentation ofSaccharomyces cerevisiae J-5 in 10 L bioreactor

3～14 h細胞的平均比生長速率約為0.076 h-1，這與策略3中生長速率一致，14 h細胞干重達36.44 g/L。增加檸檬酸鈉加量后，總糖在2～9 h維持在4.5 g/L左右，比策略3中殘?zhí)?3 g/L左右)提高50%，說明在流加糖速率相同的情況下，增加檸檬酸鈉可以降低菌體對糖的利用速率。乙醇在3～7 h緩慢下降，并在7～14 h維持在11 g/L左右，胞內(nèi)谷氨酸質(zhì)量分數(shù)快速升至8 h的3.41%，后緩慢地于11 h達到峰值(3.7%)。此過程中生物量由25.72 g/L增加到35.04 g/L，但胞內(nèi)谷氨酸幾乎沒有減少，保持著胞內(nèi)游離谷氨酸高含量狀態(tài)。此外，9 h后總糖質(zhì)量濃度上升了2.81 g/L，但乙醇質(zhì)量濃度由12 g/L緩慢下降至10 g/L，說明在檸檬酸鈉的作用下，糖代謝基本不存在乙醇溢流現(xiàn)象，甚至乙醇還代謝回補TCA循環(huán)。碳源有效代謝并流向谷氨酸合成方向，使得峰值胞內(nèi)谷氨酸質(zhì)量分數(shù)較策略1～3分別提高了62.3%、26.3%、4.52%，雖然該策略相較策略3峰值提高不足一成，但是，就谷氨酸質(zhì)量濃度(干重質(zhì)量濃度×谷氨酸質(zhì)量分數(shù))而言，該策略達到了1.14 g/L，比策略1～3分別提高了45.3%、30.2%、21.1%。14～18 h菌體二次生長，平均比生長速率約0.024 h-1，比策略3同期高 32.1%，原因可能是，罐內(nèi)殘?zhí)菨舛雀哂诓呗?，菌體還在緩慢利用殘?zhí)巧L。

2.6 檸檬酸鈉添加濃度/峰值菌體濃度對谷氨酸積累的影響

既然檸檬酸鈉對谷氨酸的積累有顯著地促進作用，需要考慮在工業(yè)放大生產(chǎn)中如何使用這一參數(shù)。有關檸檬酸鈉添加質(zhì)量濃度/峰值菌體濃度(Cit/DW)的數(shù)據(jù)如表1所示。策略3流加的檸檬酸不足以抑制溢流代謝(圖4)，雖然比策略2的胞內(nèi)谷氨酸提高了20.4%，但是增加檸檬酸鈉后(策略4)，溢流代謝得到了有效地抑制(圖5)，谷氨酸濃度比發(fā)酵2提高了25.9%，也比策略3提高4.5%。說明就抑制溢流代謝促進谷氨酸合成而言，檸檬酸鈉的添加量以搖瓶發(fā)酵、策略2和策略4較為合適。顯然，該數(shù)據(jù)在3者中不謀而合，均為0.237左右，因此0.238±0.007可以作為工業(yè)生產(chǎn)放大實驗的依據(jù)之一。

表1 檸檬酸鈉添加濃度/菌體濃度對谷氨酸積累的影響Table 1 Effect of sodium citrate addition concentration/bacterial concentration on glutamate accumulation

注：a搖瓶發(fā)酵結束的干重；b補料結束時的干重。

3 結論

本文優(yōu)化了檸檬酸鈉-糖蜜補料策略，研究了其對釀酒酵母代謝及胞內(nèi)谷氨酸合成積累的影響，結論如下：

(1)釀酒酵母J-5在糖蜜補料發(fā)酵過程中，存在碳分解代謝阻遏效應。發(fā)酵后期菌體能利用乙醇二次生長，但二次生長效率僅為以糖蜜為碳源的生長效率的27.5%。這使得細胞對以谷氨酸為核心的胞內(nèi)“氮庫中轉”的生理需求降低，促進了谷氨酸的積累。說明促進胞內(nèi)谷氨酸積累的積極因素包括一定條件下適時地調(diào)低生長速率。

(2)發(fā)酵過程乙醇溢流對胞內(nèi)谷氨酸的積累存在消極影響，但適時地添加檸檬酸鈉可以減弱乙醇溢流代謝，促進胞內(nèi)谷氨酸的積累，可提高62.3%以上。

(3)檸檬酸鈉添加質(zhì)量濃度(Cit，g/L)可根據(jù)補料結束時菌體干重(DW)來決定，當Cit/DW在0.238±0.007時能有效抑制乙醇溢流、提高谷氨酸合成效率，可作為指導工業(yè)化放大生產(chǎn)的參考依據(jù)。