屈定武，翟齊嘯，于雷雷，田豐偉，趙建新，張灝，陳衛(wèi)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

鉛作為一種難以降解的重金屬污染物，主要通過攝食(食物)和呼吸[1-2]進(jìn)入血液循環(huán)，最終沉積在軟組織和骨骼中，對血液、骨骼、泌尿、免疫和神經(jīng)[3-7]等多種系統(tǒng)造成破壞。肝臟和腎臟是鉛毒性的主要靶器官，鉛暴露易導(dǎo)致肝壞死、腎衰竭等多種器官的病變[8-9]。鉛對機(jī)體造成毒害和損傷的機(jī)制包括影響體內(nèi)必需元素代謝的平衡，破壞線粒體和線粒體膜功能，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激與損傷[10-11]等。其中氧化應(yīng)激和氧化損傷被認(rèn)為是鉛毒性的主要機(jī)制，諸多報道表明，鉛會導(dǎo)致機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)受到抑制，促使體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧，并導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和氧化性DNA損傷，最終損害機(jī)體健康。

長期鉛暴露后會引起腸道炎癥、影響腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)[12]，對胃腸道與外環(huán)境(腸腔內(nèi)容物)之間的物理屏障及免疫屏障造成損傷。而受損的腸道屏障功能進(jìn)一步加速了腸腔內(nèi)金屬鉛向機(jī)體的滲漏和吸收[13]。哺乳動物腸道微生物的平衡被認(rèn)為是維持宿主健康的一個重要因素。在重金屬吸收和排泄的過程中，腸道菌群會不可避免地與重金屬直接接觸，作為腸道屏障的一部分，腸道菌群很可能在鉛等重金屬的吸收、分布、排泄和毒性過程發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。已有研究表明，腸道微生物限制了機(jī)體對重金屬的吸收，緩解了有毒金屬暴露對小鼠的侵害作用[13]，同時，重金屬本身亦會對腸道菌群產(chǎn)生毒害作用，過往報道表明汞[14]、鎘[15]和銅[16]均會影響腸道菌群的組成。GAO等通過16S rRNA焦磷酸測序技術(shù)研究了慢性鉛暴露對小鼠腸道細(xì)菌組成的影響，結(jié)果表明，13周口服10 mg/L的Pb會改變腸道菌群軌跡及系統(tǒng)發(fā)育多樣性[17]。

諸多體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn),多種腸道益生菌如植物乳桿菌CCFM8661[18]、魏斯氏乳桿菌、羅伊氏乳桿菌21008[19]在體外具有吸附鉛的能力，并在降低機(jī)體氧化應(yīng)激水平，表明它們具有緩解鉛毒性的潛力[20]。目前來說，益生菌主要源自于乳桿菌、雙歧桿菌屬，而其他腸道菌如阿克曼氏菌、柔嫩梭菌、擬桿菌屬被報道亦具有多種益生功能，有望成為下一代益生菌的成員[21-23]，并且在調(diào)節(jié)重金屬的生物可利用性和毒性方面也可能起著重要作用，最近一項研究表明,腸道厭氧菌普拉氏梭桿菌在腸道中定殖后能緩解無菌小鼠的急性砷毒性[24]。本實驗室前期研究結(jié)果表明,急性鉛暴露后，發(fā)現(xiàn)腸道中擬桿菌顯著減少。擬桿菌作為人類腸道的主要細(xì)菌之一，廣泛分布在哺乳動物體內(nèi)，在糖尿病[25]、肥胖[26]等疾病中發(fā)揮有益作用，被報道具有免疫調(diào)節(jié)等生理功能[27-28]。在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型中，擬桿菌抑制促炎細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的表達(dá)和增強(qiáng)抗炎IL-10的表達(dá)，從而改善結(jié)腸炎癥狀[29]。多形擬桿菌作為一種腸道常駐菌，能夠影響機(jī)體代謝，降解宿黏液多糖等難被宿主消化的營養(yǎng)物質(zhì)[30]，產(chǎn)生乙酸、丙酸等短鏈脂肪酸。此外，該菌通過促進(jìn)杯狀細(xì)胞分化可以調(diào)節(jié)結(jié)腸細(xì)胞傳導(dǎo)信號，在體內(nèi)腸黏液屏障的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用[31-32]。因此，本研究通過急性鉛暴露模型，探究多形擬桿菌FTJS-8-K對小鼠對鉛的吸收及生理毒性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

還原性谷胱甘肽、丙二醛及蛋白定量測定試劑盒：南京建成生物技術(shù)公司；DX-4000-FITC：美國Sigma公司；腦心浸肉湯培養(yǎng)基(brain heart infusion broth，BHI)：青島海博生物有限公司；乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸(色譜純)：中國國藥化學(xué)試劑公司(中國上海)；VK1、氯化血紅素：上海生物工程有限公司；多形擬桿菌FTJS-8-K、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)2016 2-3：江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心菌種保藏庫；普拉氏梭桿菌(Faecalibacteriumprausnitzii)A2-165：日本微生物菌種保藏中心。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-MS，日本島津公司；原子吸收分光光度計，美國Varian公司；Multiscan Go多功能酶標(biāo)儀，美國Thermo公司；Whitley DG250 厭氧工作站,英國DWS公司；MLS-3750型高溫高壓滅菌鍋，日本SANYO公司；Milli-Q水凈化系統(tǒng)，密理博(中國)有限公司；水平瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)、Bio-Rad S1000 PCR儀，美國伯樂(Bio-Rad)公司；Nano Photometer超微量紫外分光光度計，德國IMPLEN公司；BC-5000 Vet型全自動生化分析儀，深圳邁瑞醫(yī)療有限公司；MiSeq第二代高通量測序儀，美國Illumina公司。

1.3 多形擬桿菌的活化培養(yǎng)

將在-80 ℃甘油保存的多形擬桿菌在BHI(含體積分?jǐn)?shù)0.001% VK1和氯化血紅素)固體平板進(jìn)行劃線接種，菌種活化后，按2%的接種量接種至BHI液體培養(yǎng)基中，連續(xù)活化2代后待用。按 10%的接種量將活化的菌液接入600 mL BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫擴(kuò)大培養(yǎng)18 h，4 ℃、8 000×g離心15 min，棄去上清液，菌體以無菌PBS洗滌2次，按照前述條件再次離心，收集的菌體重懸于3%(體積分?jǐn)?shù))的甘油溶液中，-20℃儲存?zhèn)溆?，同時對菌液進(jìn)行活菌計數(shù)。

1.4 動物實驗設(shè)計

本研究采用的是購自上海斯萊克公司的C57BL/6小鼠(雄性，6周齡，SPF級，體重16～18 g)。倫理編號為JN.No20181030c0301110，18只小鼠隨機(jī)分成空白組、染鉛組和多形擬桿菌干預(yù)組。每組6只，分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為(23±2)℃，相對濕度為(50±10)%，小鼠自由飲食，采用國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料飼養(yǎng)。染鉛組一次性灌胃醋酸鉛液(每天灌胃0.2 mL，灌胃劑量為1/5 LD50，即1 304 mg Pb2+/kg體重)[33-34]，鉛暴露1 h后，干預(yù)組灌胃多形擬桿菌甘油溶液(每天灌胃0.2 mL，活菌數(shù)為1×109CFU的菌懸液)，對照組和染鉛組灌胃等量3%(體積分?jǐn)?shù))甘油。鉛暴露和干預(yù)持續(xù)3 d，每天1次。第1次鉛暴露后，分別收集小鼠0、4、8、12、24 h的糞便和尿液，4 d后，所有小鼠進(jìn)行乙醚麻醉，處死小鼠，采集組織及血液樣品待測。

1.5 小鼠組織、血液、糞便和尿液中鉛元素含量的測定

取適量濕組織、血液、糞便和尿液樣品，將其轉(zhuǎn)移至消解罐內(nèi)，加入適量濃HNO3，在微波消解系統(tǒng)中進(jìn)行消化，定容。使用火焰或石墨原子吸收分光光度計測定樣品中鉛元素含量。

1.6 小鼠血常規(guī)檢測

將全血與抗凝劑充分混勻，在血液細(xì)胞分析儀分析系統(tǒng)中選擇動物類型為小鼠，血樣模式為全血，分析儀的模式為CBC+DIFF(全血細(xì)胞計數(shù)+白細(xì)胞分類)。全血檢測的細(xì)胞類型為紅細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)8項、白細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)11項、血小板相關(guān)指標(biāo)4項，共計23項。

1.7 小鼠血清、組織中生理指標(biāo)的測定

小鼠血清中堿性磷酸酶(alkaline plospatase，ALP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)活性和肌酐(creatinine,Cre)、尿素(Urea)含量，肝腎組織丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量,均參照南京建成試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.8 小鼠糞便微生物總DNA的提取和腸道菌群高通量測序

采集小鼠糞便置于滅菌的2 mL離心管中，利用Fast DNA Spin Kit for Feces試劑盒提取糞便中微生物的總DNA。以16S V3-V4區(qū)特異性擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，按照QIA Quick Gel Extraction Kit膠回收試劑盒說明書進(jìn)行目的條帶膠回收，根據(jù)Pico Green熒光染料的定量結(jié)果，按等質(zhì)量濃度混合樣品，構(gòu)建16S V3-V4區(qū)終文庫。利用Illumina Miseq高通量測序平臺進(jìn)行高通量測序。剔除掉序列長度<200 bp、引物序列、不能拼接的單序列，按照重疊堿基>10 bp且無錯配的序列進(jìn)行拼接。將相似度>97%序列進(jìn)行OTUs(operational taxonomic unit)聚類，過濾掉含量<0.01%OTUs，再將剩下的OTUs與Ribosomal Database Project(RDP)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對注釋。將注釋后OTUs進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括Shannon和Chao 1等Alpha多樣性指數(shù)。

1.9 小鼠腸道中緊密蛋白基因表達(dá)量的測定

取小鼠小腸和結(jié)腸中段組織(約0.05 g)，在液氮下研磨至粉末，加入1 mL Trizol裂解液。利用氯仿和異丙醇提取RNA；凝膠電泳檢測RNA完整性后，使用Takara公司試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。最后以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，以β-肌動蛋白(β-actin)作為內(nèi)參基因，采用SYBR Green熒光染料嵌合法檢測ZO-1、ZO-2、Occludin和Claudin-1 mRNA?；蛐蛄袇⒄者^往文獻(xiàn)報道[35]。以 2-△△CT法計算分析數(shù)據(jù)，每次每個樣本重復(fù)3次。

1.10 小鼠結(jié)腸內(nèi)容物短鏈脂肪酸含量的測定

參照過往文獻(xiàn)報道的方法[36]，取適量小鼠結(jié)腸內(nèi)容物，凍干稱重，提取短鏈脂肪酸，使用GC-MS檢測短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸及戊酸)的含量。

1.11 鉛吸附性質(zhì)的測定

鉛吸附性質(zhì)測定根據(jù)過往文獻(xiàn)報道的方法[18]，稍有變動。將活化好的菌株按2%接種量接種到2 L液體培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)至對數(shù)期，8 000×g離心15 min，用超純水清洗沉淀2遍，重復(fù)離心以獲得菌體。將醋酸鉛溶于超純水中使溶液中鉛離子的終濃度達(dá)到50 mg/L，并將菌體重懸于該醋酸鉛溶液中使菌體濃度達(dá)到1 g/L濕菌體重量。將菌懸液pH調(diào)節(jié)至6.0后，將以上樣品置于37 ℃，于恒溫?fù)u床上以220 r/min轉(zhuǎn)速培養(yǎng)1 h，8 000×g離心15 min，取上清液，使用火焰原子吸收分光光度計測定鉛濃度。并以發(fā)酵乳桿菌2016 2-3、普拉氏梭桿菌A2-165作為對照菌株進(jìn)行上述吸附實驗。菌株對鉛的吸附能力按公式(1)計算：

(1)

式中：其中C0和C1分別代表初始體系和吸附后上清液中鉛濃度。

1.12 統(tǒng)計與分析

統(tǒng)計分析圖通過GraphPad Prism 6和R語言完成。所有統(tǒng)計分析采用SPSS(23版)。計量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，采用T檢驗進(jìn)行組間兩兩比較，采用單因素方差分析檢測多組數(shù)據(jù)，利用Mann-Whitney配對算法分析了分組樣本的相對豐度，P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 多形擬桿菌對小鼠常規(guī)生理指標(biāo)的影響

連續(xù)3 d給小鼠灌胃醋酸鉛后，小鼠體重變化及臟器指數(shù)如圖1及表1所示。與空白組相比，染鉛組小鼠體重顯著持續(xù)下降，肝、腎和腦系數(shù)顯著增加；灌胃多形擬桿菌后小鼠體重有所恢復(fù)，同時改善了由于急性鉛暴露引起的肝、腎和腦腫大。

圖1 多形擬桿菌對急性鉛暴露小鼠體重的影響Fig.1 Effect of B.thetaiotaomicron on body weight of acute lead exposed mice

表1 多形擬桿菌對急性鉛暴露小鼠臟體比值的影響Table 1 Effect of B.thetaiotaomicron on visceral body ratio of acute lead exposed mice

分組肝系數(shù)腎系數(shù)腦系數(shù)空白組0.033±0.0030.013±0.0010.017±0.001染鉛組0.039±0.003*0.016±0.001*0.022±0.002*干預(yù)組0.036±0.0030.015±0.0010.019±0.001

注：*表示與空白組相比差異顯著(P< 0.05)；**表示與空白組相比差異極顯著(P<0.01)。下同。

2.2 多形擬桿菌對小鼠血液、糞便及組織中鉛含量的影響

小鼠尿液及糞便中鉛排出量動態(tài)變化如圖2所示，在第一次鉛暴露后的12 h以內(nèi)，小鼠糞便中鉛含量持續(xù)上升，而在接下來12 h內(nèi)開始下降；而尿液中鉛含量在鉛暴露后24 h內(nèi)持續(xù)緩慢上升。多形擬桿菌干預(yù)后，糞便鉛含量顯著升高，表明多形擬桿菌通過促進(jìn)糞便鉛的排泄，從而減小了機(jī)體對鉛的吸收。尿液中鉛含量顯著下降亦表明腎臟中鉛蓄積減少。

血液、組織中鉛含量是評價鉛毒性的重要指標(biāo)，可以反映機(jī)體的鉛中毒程度，如圖3所示，在本研究中，急性鉛暴露結(jié)束后，染鉛組小鼠的血液、肝、腎和十二指腸中的鉛含量顯著高于空白組(P< 0.05)，而灌胃多形擬桿菌顯著降低了血液及肝臟、腎臟、十二指腸中的鉛含量。

a-糞便；b-尿液圖2 多形擬桿菌對急性鉛暴露小鼠不同時間點糞便及尿液中鉛含量的影響Fig.2 Effect of B.thetaiotaomicron on feces and urine lead content of acute lead exposed mice at different times注：*表示不同組之間的差異顯著(P<0.05)；**表示不同組之間的差異極顯著(P<0.01)。下同。

2.3 多形擬桿菌對急性鉛暴露小鼠肝腎氧化應(yīng)激及功能的影響

如表2所示，急性鉛暴露后，肝臟和腎臟中MDA水平上升、GSH水平下降；相比于造模組，多形擬桿菌干預(yù)后恢復(fù)了上述氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化，說明該菌對急性鉛暴露導(dǎo)致的組織氧化損傷具有保護(hù)作用。

血清ALT和AST是評價肝功能的重要指標(biāo)，血清中UREA、CREA是評價腎功能的重要指標(biāo)。急性鉛暴露后，血清中ALT、AST水平顯著上升，血清中Urea、Cre水平無明顯變化(如表3所示)。急性鉛暴露對肝臟的損傷先于腎臟，發(fā)生在暴露初期，并未達(dá)到引發(fā)腎臟病變的毒性劑量，這與前人研究結(jié)果相似[35]，故而本實驗中只檢測到肝功能的顯著變化卻沒有檢測到腎功能的顯著變化。灌胃多形擬桿菌在一定程度上恢復(fù)了上述生理指標(biāo)，表明了多形擬桿菌對急性鉛毒性的保護(hù)作用。

a-肝；b-腎；c-腦；d-血；e-十二指腸圖3 多形擬桿菌對急性鉛暴露小鼠血液、組織及糞便中鉛含量的影響Fig.3 Effect of B.thetaiotaomicron on lead content in blood and tissue of acute lead exposed mice注：ns表示無顯著差異。

表2 多形擬桿菌對急性鉛暴露小鼠組織中MDA、GSH含量的影響Table 2 Effect of B.thetaiotaomicron on the levels of MDA and GSH in the tissues of acute lead exposed mice

組別肝臟腎臟GSH/(mg·g-1 蛋白)MDA/(nmol·g-1 蛋白)GSH/(mg·g-1 蛋白)MDA/(nmol·g-1 蛋白)空白組4.68±0.3441±115.01±0.4339±9染鉛組0.96±0.19** 136±25**1.21±0.22**120±18** 干預(yù)組2.30±0.78 94±16##2.24±0.7872±14#

注：#表示與染鉛組相比有顯著差異(P< 0.05)；##表示與染鉛組相比有極顯著差異(P<0.01)。

表3 多形擬桿菌對急性鉛暴露小鼠血清生化指標(biāo)的影響Table 3 Effect of B.thetaiotaomicron on serum biochemical changes of acute lead exposed mice

2.4 多形擬桿菌對急性鉛暴露小鼠血液學(xué)參數(shù)的影響

如表4、表5所示，急性鉛暴露后，血紅蛋白含量顯著下降，血小板含量、嗜中心粒細(xì)胞數(shù)量顯著上升(P< 0.05)，其他血液參數(shù)基本無顯著變化。多形擬桿菌干預(yù)之后，相比于造模組，基本血細(xì)胞參數(shù)和血液免疫學(xué)參數(shù)均無顯著變化。

表4 多形擬桿菌對急性鉛暴露小鼠基本血細(xì)胞參數(shù)的影響Table 4 Effect of B.thetaiotaomicron on basic hematological parameters of acute lead exposed mice

注：RBC-紅細(xì)胞；HGB-血紅蛋白濃度；MCV-紅細(xì)胞平均體積；MCHC-平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度；RDW-紅細(xì)胞分布寬度；CV-變異系數(shù)；SD-標(biāo)準(zhǔn)差；PLT-血小板。

表5 多形擬桿菌對急性鉛暴露小鼠血液免疫學(xué)參數(shù)的影響Table 5 Effect of B.thetaiotaomicron on haematogenic immunity paramaters of acute lead exposed mice

注：Neu-嗜中性粒細(xì)胞；Lym-淋巴細(xì)胞；WBC-白細(xì)胞；Mon-單核細(xì)胞；Bas-嗜堿性粒細(xì)胞；Eos-嗜酸性粒細(xì)胞。

2.5 多形擬桿菌對急性鉛暴露腸道菌群多形性和組成的影響

2.5.1 多形擬桿菌對急性鉛暴露小鼠腸道α多樣性的影響

α多樣性指數(shù)值越大，表示菌群多樣性和均勻度越高，菌群多樣性指數(shù)比較結(jié)果如圖4所示，急性鉛暴露后，染鉛組小鼠Chao 1和Shannon指數(shù)顯著下降，表明染鉛后小鼠腸道菌群多樣性下降，灌胃多形擬桿菌后，以上系數(shù)得到顯著恢復(fù)。

2.5.2 多形擬桿菌對急性鉛暴露小鼠腸道關(guān)鍵菌屬相對豐度的影響

在屬(genus)水平上，急性鉛暴露后，腸桿菌屬(Enterobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、埃希氏桿菌屬(Escherichia)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)的相對豐度顯著增加(P<0.05)，Rikenellaceae__unclassified、Lachnospiraceae__unclassified、S24-7__unclassified、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)和擬桿菌屬的相對豐度顯著下降(P< 0.05)，多形擬桿菌干預(yù)后，與染鉛

a-Chao 1指數(shù)；b-Shannon指數(shù)圖4 多形擬桿菌對急性鉛暴露小鼠腸道菌群α多樣性的影響Fig.4 Effect of B.thetaiotaomicron on α diversity index of gut microbiota acute lead exposed mice

組相比，腸桿菌屬、假單胞菌屬、埃希氏桿菌屬和葡萄球菌屬等條件致病菌的相對豐度顯著下降，而腸道中瘤胃菌科、毛螺菌科、擬桿菌等產(chǎn)酸菌的含量得到一定程度的恢復(fù)(圖5)。

a-Bacteroidales_Other;b-S24-7_unclassified;c-Staphylococcus;d-Lachnospiraceae[Ruminococcus];e-Ruminococcus;f-Enterobacter;g-Escherchiar;h-Pseudomonas;i-Rikenellaceae_unclassfied圖5 多形擬桿菌對急性鉛暴露小鼠腸道菌群中關(guān)鍵菌屬的影響Fig.5 Effect of B.thetaiotaomicron on relative abundance of key bacterial genera in the intestinal flora in acute lead exposed mice

2.6 多形擬桿菌對急性鉛暴露小鼠腸道緊密連接蛋白的影響

急性鉛暴露24 h后，小鼠空腸與結(jié)腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1、ZO-2、Occludin和Claudin-1 mRNA相對表達(dá)量明顯下降(P<0.05)。說明急性鉛毒性對腸上皮緊密連接功能造成了較大影響。多形擬桿菌干預(yù)之后，相比于造模組，空腸與結(jié)腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白相對表達(dá)量明顯增加(P<0.05)，表明灌胃多形擬桿菌可以防止鉛毒性對緊密連接蛋白的損傷(圖6)。

2.7 多形擬桿菌對急性鉛暴露小鼠腸道短鏈脂肪酸含量的影響

如圖7所示，相比于空白組，染鉛組小鼠結(jié)腸內(nèi)容物中總短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸及戊酸)的產(chǎn)生量顯著減少(P<0.01)，多形擬桿菌干預(yù)之后，相比于染鉛組，結(jié)腸內(nèi)容物中總短鏈脂肪酸的產(chǎn)生量顯著增加(P<0.05)，其中乙酸含量顯著增加(P<0.05)。

a-結(jié)腸；b-空腸圖6 多形擬桿菌對急性鉛暴露小鼠腸道緊密連接蛋白表達(dá)量的影響Fig.6 Effect of B.thetaiotaomicron on mRNA expression of tight junction proteins in representative sections of colon andterminal jejunum of acute lead exposed mice

圖7 多形擬桿菌對急性鉛暴露小鼠腸道中短鏈脂肪酸含量的影響Fig.7 Effect of B.thetaiotaomicron on the content of intestinal SCFAs of acute lead exposed mice

2.8 多形擬桿菌對鉛的吸附性質(zhì)

如表6所示，測定多形擬桿菌FTJS-8-K在始鉛質(zhì)量濃度為50 mg/L的體系中對鉛的吸附能力，以鉛的移除率表示，發(fā)現(xiàn)其吸附率高于發(fā)酵乳桿菌2016 2-3，但低于普拉氏梭桿菌A2-165，此菌作為下一代益生菌，最近被報道均有緩解急性砷毒性的作用[24]，以上結(jié)果表明多形擬桿菌或其代謝產(chǎn)物對鉛離子具備一定的吸附能力。

表6 多形擬桿菌對鉛的吸附能力Table 6 Pb absorption of B.thetaiotaomicron

3 討論

本實驗利用動物模型分析多形擬桿菌對小鼠急性鉛毒性的影響，急性鉛暴露導(dǎo)致體內(nèi)氧化應(yīng)激增加，氧化還原電位升高，具體表現(xiàn)在肝腎組織中GSH含量顯著下降，MDA含量顯著上升，并且導(dǎo)致腸道通透性增加，腸道中條件致病菌大量增殖，短鏈脂肪酸含量下降，多形擬桿菌干預(yù)后促進(jìn)了鉛從糞便中排出，限制了鉛在組織及血液中的蓄積，減輕了組織中氧化損傷，改善了腸道微環(huán)境，保護(hù)了腸道屏障，促進(jìn)腸道中短鏈脂肪酸的生成，緩解了急性鉛暴露對機(jī)體組織造成的毒性。

灌胃多形擬桿菌后，多形擬桿菌菌體本身對鉛離子具有一定的吸附能力，在機(jī)體吸收之前搶先吸附鉛離子，促進(jìn)了糞便中鉛元素的排出，從而緩解了鉛對機(jī)體造成的損傷。同時，有文獻(xiàn)報道該菌在惡劣環(huán)境中具有較強(qiáng)的定殖能力[37]，在一定程度上抑制了葡萄球菌、腸桿菌等條件致病菌的侵襲和定殖，多形擬桿菌在腸道中還具有抗炎作用，改善的腸道微環(huán)境也促進(jìn)腸道中擬桿菌、瘤胃球菌屬和毛螺菌等的增殖，強(qiáng)化的生物屏障阻止了腸腔內(nèi)重金屬鉛向機(jī)體滲漏和轉(zhuǎn)運(yùn)，限制了鉛對機(jī)體健康產(chǎn)生更大的危害。

腸道微生物組成的改變導(dǎo)致代謝產(chǎn)物改變，急性鉛暴露小鼠結(jié)腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸含量顯著下降，也會進(jìn)一步影響機(jī)體健康，這可能是由于產(chǎn)酸微生物遭到破壞引起的，丁酸鹽是腸道上皮細(xì)胞的主要能量來源[38]，丁酸鹽含量的降低會導(dǎo)致能量供應(yīng)不足，進(jìn)而導(dǎo)致腸道運(yùn)輸、蠕動和合成等生理功能受損。有文獻(xiàn)報道產(chǎn)丁酸菌主要分屬于瘤胃菌科、毛螺菌科、理研菌科以及擬桿菌的一些成員，多形擬桿菌在一定程度上促進(jìn)了瘤胃球菌、S24-7和Rikenellaceae等菌的生長，增強(qiáng)腸道中短鏈脂肪酸的分泌，從而影響緊密連接蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)腸道屏障功能[39-40]；多形擬桿菌和F.prausnitzii在體內(nèi)和體外均是代謝互補(bǔ)的，多形擬桿菌能夠降解宿主黏液多糖和生產(chǎn)乙酸鹽，從而促進(jìn)產(chǎn)丁酸菌如F.prausnitzii的增殖[41]，F(xiàn).prausnitzii利用由多形擬桿菌產(chǎn)生的醋酸鹽，反過來產(chǎn)生丁酸鹽，從而觸發(fā)包括調(diào)節(jié)黏蛋白的合成和分泌的諸多效應(yīng)信號[32, 42]。由腸道杯狀細(xì)胞分泌的黏蛋白、水及無機(jī)鹽等形成的腸黏膜屏障在維持宿主與微生物體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用，能夠使腸上皮細(xì)胞免受腸腔內(nèi)容物及異源物質(zhì)的損害[43]。多形擬桿菌通過修飾體內(nèi)杯狀細(xì)胞和黏蛋白糖基化調(diào)節(jié)腸黏液屏障。有文獻(xiàn)報道該菌能誘導(dǎo)無菌大鼠結(jié)腸黏蛋白基因表達(dá)，增強(qiáng)杯狀細(xì)胞分化[32]。在另一種小鼠模型中，擬桿菌通過調(diào)節(jié)緊密連接蛋白和細(xì)胞因子表達(dá)來強(qiáng)化上皮屏障[44]。

多形擬桿菌參與宿主物質(zhì)代謝、促進(jìn)宿主營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，在調(diào)節(jié)免疫、維持正常腸道生理功能等多個方面發(fā)揮重要作用，因此，多形擬桿菌有望成為下一代益生菌，本研究表明多形擬桿菌可以促進(jìn)鉛從糞便排出，緩解氧化應(yīng)激、保護(hù)腸道屏障，對機(jī)體急性鉛毒性具有緩解作用。利用特定腸道微生物調(diào)節(jié)重金屬暴露引起的機(jī)體損傷，或可為緩解食源性重金屬暴露對機(jī)體健康造成的危害提供新的思路和解決方法。但目前對多形擬桿菌的安全性評價尚未進(jìn)行，在食品中得到實際應(yīng)用還有待研究，并且其生長條件需嚴(yán)格厭氧，同時，該菌的培養(yǎng)條件尚不明確，還未開發(fā)出專用的食用級培養(yǎng)基，需要我們進(jìn)一步對多形擬桿菌的使用安全性和培養(yǎng)條件進(jìn)行探討。