吳興達(dá)，呂群松 （廣東醫(yī)科大學(xué)信息工程學(xué)院，廣東湛江 524023）

目前腫瘤的檢測手段主要基于影像學(xué)和病理學(xué)檢查[1-2]，這些檢測較難發(fā)現(xiàn)早期癥狀，患者容易錯過最佳治療時間。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)是原發(fā)腫瘤擴(kuò)散轉(zhuǎn)移的重要途徑，在早期腫瘤患者血液中便能檢測到；捕獲和富集腫瘤患者血液中的CTC，有利于腫瘤轉(zhuǎn)移的早期診斷、個體化治療方案的定制、腫瘤治療效果評估及其轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究[3]。由于CTC在外周血中數(shù)量極其稀少，提高CTC檢測準(zhǔn)確性和靈敏度是高純、高效富集CTC的關(guān)鍵。然而目前同時滿足高純度和高捕獲率的分離富集還存在著巨大挑戰(zhàn)。鑒于抗原和抗體結(jié)合的高特異性和高親和力，抗體修飾的材料可捕獲到純度較高的CTC。為了提高CTC的捕獲率，探討細(xì)胞捕獲率與材料表面微結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，本文制備了3種具有不同微米或納米級結(jié)構(gòu)特征的TiO2表面，并以光滑表面作對照，觀察不同微結(jié)構(gòu)表面CTC的粘附、鋪展等行為，分析其與細(xì)胞捕獲率之間的關(guān)聯(lián)。

1 材料和方法

1.1 材料

鈦酸四丁酯、(3-巰基丙基)三甲氧基硅烷(MPTMS)、馬來酰亞胺丁酸-N-琥珀酰亞胺酯交聯(lián)劑(GMBS)、鏈霉親和素(SA)、生物素化的anti-EpCAM等主要試劑均購自Sigma公司；聚二甲基硅氧烷(PDMS)購自美國Momentive公司；人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、人宮頸癌細(xì)胞Hela由中國科學(xué)院細(xì)胞庫/干細(xì)胞庫提供。

1.2 方法

1.2.1 材料制備 納米結(jié)構(gòu)用水熱反應(yīng)法制備、微米結(jié)構(gòu)用溶膠凝膠法和真空輔助軟壓印法制備。由0.3 mL鈦酸四丁酯、22 mL去離子水和18 mL鹽酸組成的前驅(qū)液倒入高壓釜內(nèi)膽，氟摻雜氧化錫(FTO)玻璃斜靠內(nèi)膽，在140 °C下水熱6 h生長TiO2納米線獲得納米結(jié)構(gòu)；以荷葉為模板制備PDMS負(fù)結(jié)構(gòu)印章，再在TiO2溶膠凝膠上壓印出微米柱陣列，燒結(jié)后獲得仿荷葉微米結(jié)構(gòu)。在微米結(jié)構(gòu)基底上按上述水熱反應(yīng)條件生長納米線，獲得仿荷葉微納結(jié)構(gòu)。

1.2.2 材料表面抗體修飾 4種結(jié)構(gòu)基底浸泡在4%(體積分?jǐn)?shù))的MPTMS乙醇溶液中10 h，分別用乙醇和二甲亞砜(DMSO)清洗3次后，浸入GMBS中60 min，再將鏈霉親和素(SA)接枝到GMBS上，用PBS緩沖液沖洗掉未能接上的SA。最后將生物素化的anti-EpCAM滴在基底上，孵育1 h后用PBS緩沖液清洗。修飾抗體后材料放在4 ℃冰箱內(nèi)待用。

1.2.3 細(xì)胞捕獲實驗 選取人乳腺癌細(xì)胞MCF-7作為目標(biāo)細(xì)胞，EpCAM低表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞Hela作為對照。將4種結(jié)構(gòu)基底置于6孔板，每孔加入3 mL特定濃度的MCF-7細(xì)胞懸浮液，然后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，37 ℃、5% CO2的環(huán)境下培養(yǎng)。將分別孵育30、45、60、75 min后的基底取出，用PBS潤洗除去未捕獲的細(xì)胞。俘獲細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，加入2 mL PBS以及20 μL熒光染色劑FDA進(jìn)行染色處理10 min，染色后用PBS潤洗3～5次，除去殘留在基底表面的FDA，最后置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞捕獲情況。

1.2.4 掃描電鏡觀察捕獲細(xì)胞 捕獲細(xì)胞用4%多聚甲醛固定后，使用梯度酒精(30%、50%、70%、90%、100%)脫水。觀察前噴金25 s。

1.2.5 細(xì)胞增殖實驗 將帶捕獲細(xì)胞的基底置于新鮮DMEM培養(yǎng)液中連續(xù)培養(yǎng)24 h，用鈣黃綠素和碘化丙啶染色處理后在熒光顯微鏡下觀察增殖情況。

1.2.6 細(xì)胞捕獲率的計算 熒光顯微鏡下計算捕獲細(xì)胞個數(shù)，細(xì)胞捕獲率定義為實驗細(xì)胞密度與理論細(xì)胞密度之比。實驗細(xì)胞密度指熒光顯微鏡視野下的細(xì)胞個數(shù)n除以該視野面積α，理論細(xì)胞密度指細(xì)胞總數(shù)N除以6孔板一個孔的底面積A。即

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析和q檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 納米結(jié)構(gòu)、微米結(jié)構(gòu)及微納結(jié)構(gòu)的掃描電鏡觀察結(jié)果

掃描電子顯微鏡(SEM)觀察3種TiO2表面，結(jié)果見圖1。圖1(a)所示的納米結(jié)構(gòu)中，大量納米線均勻分布在FTO玻璃上，其直徑約70 nm，長約800 nm。圖1(b)是仿荷葉分布的微米柱陣列，微米柱隨機(jī)分布，高度和直徑均為4～6 μm，間距為6～22 μm。圖1(c)所示的仿荷葉微納結(jié)構(gòu)具有與圖1(b)相同的微米柱分布，但其基底和微米柱表面布滿了納米線。圖1(d)展現(xiàn)微納結(jié)構(gòu)中一個微米柱的高倍電鏡照片，圖中可見微米柱表面及其周圍基底覆蓋著大量納米線。

2.2 4種結(jié)構(gòu)表面MCF-7細(xì)胞形貌的觀察

4種結(jié)構(gòu)表面MCF-7細(xì)胞的形貌具有明顯差異。光滑玻璃表面的細(xì)胞呈半球形，無偽足伸出，細(xì)胞因未鋪展開而顯得較小，如圖2(a)所示。微米結(jié)構(gòu)表面的細(xì)胞則粘附在微米柱旁，如圖2(b)所示。納米結(jié)構(gòu)表面的細(xì)胞伸出很多偽足，偽足短而密，鋪展開后連成片，見圖2(c)。而微納結(jié)構(gòu)表面的細(xì)胞同樣伸出片狀偽足，但偽足鋪展得遠(yuǎn)，并有向附近微米柱延伸的趨勢，見圖2(d)。

圖1 SEM照片

圖2 4種結(jié)構(gòu)上捕獲細(xì)胞的SEM照片

2.3 微米柱間距對細(xì)胞鋪展的影響

微納結(jié)構(gòu)中的微米柱間距對細(xì)胞鋪展有顯著影響。圖3(a)中細(xì)胞攤開鋪展在兩個微米柱之間，其直徑約15.5 μm；圖3(b)中細(xì)胞完全攤開，鋪展在4個微米柱之間，其直徑接近20 μm，而這4個微米柱兩兩之間的距離分別為8.9、14.4 、11.1、18.7 μm。相比之下，圖2(d)中細(xì)胞直徑只有13 μm，扁平程度明顯不及圖3中的情況，這可能與其兩端的微米柱間距較大有關(guān)(21 μm)。

圖3 微米柱間距對MCF-7形貌的影響

2.4 捕獲細(xì)胞的增殖情況

在捕獲細(xì)胞孵育24 h后，微納結(jié)構(gòu)表面的細(xì)胞呈現(xiàn)明顯增殖，細(xì)胞密度最大，單位面積細(xì)胞數(shù)為170個，明顯多于其他3種結(jié)構(gòu)界面，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖4 捕獲MCF-7在4種不同結(jié)構(gòu)基底上的增殖情況

2.5 4種界面結(jié)構(gòu)的MCF-7和Hela細(xì)胞捕獲率

隨著孵育時間(30～60 min)的延長，4種結(jié)構(gòu)表面的捕獲細(xì)胞逐漸增多(P<0.01)；60 min后細(xì)胞捕獲率基本不再增加；孵育60 min時，微納結(jié)構(gòu)的細(xì)胞捕獲率最高，光滑表面則最低(P<0.01)，詳見表1。

表1 4種結(jié)構(gòu)界面在不同時間MCF-7細(xì)胞捕獲率的比較(±s，n=5，%)

表1 4種結(jié)構(gòu)界面在不同時間MCF-7細(xì)胞捕獲率的比較(±s，n=5，%)

與同組30 min比較：aP<0.01；與同組45 min比較：bP<0.01；與光滑表面、微米結(jié)構(gòu)組60 min比較：cP<0.01

界面結(jié)構(gòu)光滑表面組微米結(jié)構(gòu)組納米結(jié)構(gòu)組微納結(jié)構(gòu)組30 min 0.6±0.2 7.6±0.8 28.0±4.8 30.2±4.2 45 min 1.2±0.4 15.6±4.1 53.3±5.8 64.8±7.4 60 min 2.3±0.6ab 23.1±2.8ab 67.2±6.3a 74.2±10.8ac 75 min 2.3±0.9 23.1±3.1 68.0±5.3 75.6±12

2.6 4種結(jié)構(gòu)界面MCF-7和Hela細(xì)胞捕獲率的比較

孵育60 min后，4種結(jié)構(gòu)對Hela的捕獲率均顯著低于MCF-7，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表2 4種結(jié)構(gòu)界面MCF-7和Hela細(xì)胞捕獲率的比較(±s，n=5，%)

表2 4種結(jié)構(gòu)界面MCF-7和Hela細(xì)胞捕獲率的比較(±s，n=5，%)

兩組比較均P<0.01

細(xì)胞類型MCF-7 Hela微納結(jié)構(gòu)74.2±10.8 2.2±0.4光滑表面2.3±0.6 1.1±0.3微米結(jié)構(gòu)23.1±2.8 0.9±0.3納米結(jié)構(gòu)67.2±6.3 2.3±0.6

3 討論

循環(huán)腫瘤細(xì)胞是從原位腫瘤病灶脫落，侵襲并進(jìn)入外周血液循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞，該細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移的必要前提。然而患者外周血中CTC的含量極其稀少，對其檢測非常困難。目前CTC的分選富集策略有兩大類，一類是物理分選法，依據(jù)CTC與正常血細(xì)胞間的大小、形變性、密度等物理特性存在的差異性設(shè)計方法進(jìn)行分選，例如微過濾器法和密度梯度離心法[4-5]；另一類是親和識別分離法，用具有專一性識別作用的抗體、適配體等生物活性大分子識別CTC表面特異性表達(dá)的蛋白標(biāo)志物，通過兩者之間的特異性識別達(dá)到分選CTC的目的，例如唯一經(jīng)過美國食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證的CellSearch系統(tǒng)[6]。盡管這些方法能成功捕獲和分選CTC，但仍未能實現(xiàn)臨床檢測和診斷所需高純、高效的分離富集。因此開發(fā)新的先進(jìn)材料界面及分選技術(shù)顯得十分重要。設(shè)計和制備各種微納米結(jié)構(gòu)基底，是免疫親合法捕獲CTC的一個研究熱點(diǎn)。微納米結(jié)構(gòu)能增強(qiáng)細(xì)胞偽足、微絨毛與基底之間的拓?fù)湎嗷プ饔?，促進(jìn)細(xì)胞粘附，提高CTC捕獲效率[7]。多種納米結(jié)構(gòu)已經(jīng)被構(gòu)建用于CTC捕獲，包括納米線[8]、納米片[9]、納米纖維[10]、納米孔[11]等。近期報道的分形金納米結(jié)構(gòu)界面[12]、仿白細(xì)胞的微納多級界面[13]、仿玫瑰花瓣的微納結(jié)構(gòu)界面[14]，以及多級納米線陣列[15]，在CTC捕獲中由于細(xì)胞與材料界面的相互作用大大增強(qiáng)，捕獲率得到極大的提高。

設(shè)計和構(gòu)建新的微納結(jié)構(gòu)材料界面，對于進(jìn)一步提高CTC捕獲率和揭示細(xì)胞與材料間相互作用的機(jī)制都具有重要意義。本實驗利用新鮮荷葉作為模板，通過PDMS印章在TiO2溶膠凝膠表面復(fù)制出荷葉表面的微米結(jié)構(gòu)，再通過水熱反應(yīng)在微米結(jié)構(gòu)基底上生長均勻致密的納米線以模仿荷葉表面的納米結(jié)構(gòu)，從而得到仿荷葉微納結(jié)構(gòu)界面。該結(jié)構(gòu)界面主要應(yīng)用于超疏水領(lǐng)域，少量文獻(xiàn)報道將其作為生物材料界面在骨組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用，但在CTC捕獲方面尚未見有報道。研究表明相對于光滑和微米結(jié)構(gòu)表面，成骨細(xì)胞在仿荷葉微納結(jié)構(gòu)表面表現(xiàn)出更好的粘附和更高的細(xì)胞活性[16-17]。本實驗將光滑F(xiàn)TO玻璃、單一微米結(jié)構(gòu)、單一納米結(jié)構(gòu)和微納結(jié)構(gòu)表面分別應(yīng)用于CTC捕獲，結(jié)果同樣也展現(xiàn)了微納結(jié)構(gòu)界面在促進(jìn)細(xì)胞快速粘附和增殖方面的優(yōu)越性。

光滑表面上的細(xì)胞仍然保持球形，沒有偽足伸出，表明細(xì)胞與材料之間的相互作用非常弱；微米結(jié)構(gòu)表面的細(xì)胞傾向于粘附在微米柱旁，表明微米柱能夠給細(xì)胞提供粘附點(diǎn)；而納米結(jié)構(gòu)表面的細(xì)胞有許多偽足伸出，表明細(xì)胞與材料之間的拓?fù)湎嗷プ饔茫c文獻(xiàn)報道一致[15]。相比之下，微米柱和納米線共存的微納結(jié)構(gòu)表面，不僅具有最大的比表面積，抗體在基底表面的負(fù)載量最大，更重要的是，在促進(jìn)細(xì)胞粘附鋪展方面，微米柱和納米線發(fā)生了協(xié)同作用，細(xì)胞伸出偽足與納米結(jié)構(gòu)相互作用，同時偽足的伸展又受鄰近微米柱引導(dǎo)，使細(xì)胞鋪展面積更大。

仿荷葉表面結(jié)構(gòu)中，微米柱的間距并非一致，大致為6～22 μm。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，相對于20 μm以上的間距，15 μm左右的微米柱明顯更有利于細(xì)胞的鋪展，表明微米柱與細(xì)胞的距離合適，其引導(dǎo)細(xì)胞鋪展的作用就會變得更明顯。因此，優(yōu)化微納結(jié)構(gòu)中的微米柱間距是進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞與材料界面相互作用的一個有效途徑。在捕獲細(xì)胞增殖實驗中，微納結(jié)構(gòu)界面具有最密的細(xì)胞分布，表明該界面具有良好的細(xì)胞相容性，這對于后期的細(xì)胞長時間培養(yǎng)是非常有利的。

在4種結(jié)構(gòu)界面中微納結(jié)構(gòu)最有利于CTC的粘附、鋪展和增殖，表明細(xì)胞與材料表面的相互作用最強(qiáng)。因此在CTC捕獲實驗中，微納結(jié)構(gòu)界面體現(xiàn)出最佳的細(xì)胞捕獲特性，細(xì)胞捕獲率高達(dá)74%，是光滑表面的32倍?？梢灶A(yù)見，通過進(jìn)一步優(yōu)化微米柱間距，微納結(jié)構(gòu)界面的細(xì)胞捕獲率將能進(jìn)一步提高，有望在腫瘤診斷中發(fā)揮輔助作用。