馬鳳娟 孫杰 徐培智 解開(kāi)治 李夏 顧文杰 盧鈺升 徐如玉

摘要：【目的】研究生防菌解淀粉芽孢種菌XP1對(duì)香蕉根際土壤細(xì)菌群落多樣性的影響，揭示生防菌防治香蕉枯萎病的土壤微生物學(xué)機(jī)制，為利用生防菌防控香蕉枯萎病提供理論參考?！痉椒ā吭囼?yàn)設(shè)3個(gè)處理：CK，健康蕉園+每株0.5 L滅菌PDA培養(yǎng)基灌根+每株0.5 L滅菌LB培養(yǎng)基灌根;DI，健康蕉園+香蕉枯萎病菌（菌液濃度1×109個(gè)/mL，接種量0.5 L/株）+每株0.5 L滅菌LB培養(yǎng)基;TR，健康蕉園+香蕉枯萎病菌（菌液濃度1×109個(gè)/mL，接種量0.5 L/株）+生防菌（菌液濃度1×109個(gè)/mL，接種量0.5 L/株）。利用Illumina Hiseq 2500高通量測(cè)序平臺(tái)，對(duì)3個(gè)處理香蕉植株的根際土壤分別提取總DNA并構(gòu)建16S rDNA基因文庫(kù)，進(jìn)而對(duì)微生物群落多樣性進(jìn)行分析。【結(jié)果】生防菌XP1對(duì)香蕉枯萎病的防效試驗(yàn)結(jié)果顯示，CK處理香蕉植株無(wú)發(fā)病現(xiàn)象;DI處理在接種香蕉枯萎病菌后蕉園的發(fā)病率達(dá)95.0%，病情指數(shù)為68.3;TR處理接種生防菌后蕉園的發(fā)病率為13.3%，病情指數(shù)降低至10.8，防治效果達(dá)84.2%。共測(cè)序獲得886890個(gè)有效序列，在97%的相似水平下聚類(lèi)后獲得61660個(gè)OTUs，歸屬于40個(gè)細(xì)菌門(mén)。3個(gè)處理的OTUs數(shù)量表現(xiàn)為CK>DI>TR。變形菌門(mén)（Proteobacteria）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、浮霉菌門(mén)（Planctomycetes）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）、OD1、硝化螺旋菌門(mén)（Nitrospirae）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）和疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）是3個(gè)處理共有的菌門(mén)，其中變形菌門(mén)是CK、DI和TR處理的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，分別占各自相對(duì)豐度≥1%物種的32.21%、28.94%和53.78%。TR處理的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均顯著低于CK和DI處理（P<0.05，下同），Dominance指數(shù)顯著大于CK和DI處理，Chao1指數(shù)和Observed species指數(shù)大于DI處理、小于CK處理;接種生防菌后，TR處理的Chao1指數(shù)和Observed species指數(shù)較DI處理分別提高7.3%和0.7%?！窘Y(jié)論】接種生防菌XP1能有效防控大田香蕉枯萎病的發(fā)生，提高香蕉根際土壤細(xì)菌物種豐富度和有益菌比例，促進(jìn)根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征向健康土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征的方向演替，具有一定的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞： 香蕉枯萎病;根際土壤;生防菌;高通量測(cè)序;微生物多樣性

中國(guó)分類(lèi)號(hào)： S436.681;S476? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? ? ? ?文章編號(hào)：2095-1191（2019）09-1981-09

Abstract：【Objective】The study was conducted to reveal the effects of Bacillus amyloliquefaciens XP1 on the diversity of bacterial communities in rhizosphere soil of banana tree， show the soil microbiological mechanism of biocontrol agents and provide theoretical basis for biological control of banana fusarium wilt. 【Method】Three treatments were set up in this study：CK， healthy banana orchard+0.5 L sterilized PDA medium irrigating root per plant+0.5 L sterilized LB me-dium irrigating root per plant;DI， healthy banana orchard+banana fusarium wilt strain（bacterial solution concentration was 1×109/mL， inoculation amount was 0.5 L/plant）+0.5 L per plant sterilized LB medium;TR， healthy banana orchard+banana fusarium wilt strain（bacterial solution concentration was 1×109 /mL， inoculation amount was 0.5 L/plant） and biocontrol agent（bacterial solution concentration was 1×109 /mL， inoculation amount was 0.5 L/plant）. Using Illumina Hiseq 2500 high-throughput sequencing platform， total DNA was extracted from the rhizosphere soil of three banana plants treatments and 16S rDNA gene library was constructed to analyze the diversity of microbial communities. 【Result】The control test of XP1 on banana fusarium wilt indicated that there was no diseased banana plants in CK treatment， the incidence of banana orchard in DI treatment after inoculation of banana fusarium wilt fungus was 95.0% with disease index of 68.3. The incidence of banana orchard in TR treatment was 13.3% with disease index of 10.8， and the control effect was 84.2%. A total of 886890 valid sequences were obtained by sequencing， and 61660 OTUs（operational taxonomic unit） belonging to 40 phyla were obtained by clustering at 97% similarity level. The number of OTUs of the three treatments were in the following order：CK>DI>TR. Among them， Proteobacteria， Acidobacteria， Planctomycetes， Chloroflexi， Gemmatimonadetes， OD1， Nitrospirae， Firmicutes， Bacteroidetes， Actinobacteria and Verrucomrobia were the shared bacteria in three treatments. Among them， the dominant bacteria in CK， DI and TR were Proteobacteria， accounting for 32.21%， 28.94% and 53.78% of the species with relative abundance? irrigating root per plant 1%. The Shannon index and Simpson index of TR treatment were significantly lower than those of CK and DI treatments（P<0.05， the same below）， dominance index was significantly higher than that of CK and DI treatment， Chao1 index and Observed species index of TR treatment were larger than those of DI treatment and less than those of CK treatment. After biocontrol agent inoculation， the Chao 1 index and the Observed species index of TR treatment increased by 7.3% and 0.7%， respectively compared with DI treatment. 【Conclusion】The inoculation of XP1 can effectively prevent the occurrence of banana fusarium wilt in the field， improve the bacterial species richness in rhizosphere soil and proportion of beneficial bacteria， and promote the rhizosphere soil bacterial community succession towards direction of that in healthy soil. Therefore， it has potential in application.

Key words： banana fusarium wilt; rhizosphere soil; biocontrol agent; high-throughput sequencing; microbial diversity

0 引言

【研究意義】香蕉作為熱帶和亞熱帶水果在人們的日常生活中扮演著重要角色。近年來(lái)，隨著香蕉枯萎病的不斷加劇和蔓延，已給我國(guó)乃至全球香蕉產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了重創(chuàng)（肖愛(ài)萍和游春平，2005）。香蕉枯萎病是一種極具破壞性的土傳病害，其發(fā)病過(guò)程為尖孢鐮刀菌侵染香蕉維管束，維管束腐爛壞死，香蕉枯萎死亡（聶燕芳等，2017）。香蕉枯萎病于1967年首次出現(xiàn)在我國(guó)臺(tái)灣省，隨后從廣東蔓延至福建，并迅速擴(kuò)展到海南、廣西、云南等其他香蕉種植區(qū)（鄧鐵軍等，2015;周維等，2017），嚴(yán)重威脅我國(guó)香蕉種植業(yè)的發(fā)展。目前應(yīng)對(duì)香蕉枯萎病的主要措施有化學(xué)防治、物理防治、培育抗病品種、生物防治及田間綜合管理等，其中，生物防治措施憑借其對(duì)環(huán)境污染小、安全程度高、能提高香蕉產(chǎn)量和品質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)而越來(lái)越受到研究者們的重視（丁文娟等，2014;賴(lài)朝圓等，2018）。研究發(fā)現(xiàn)，土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)與香蕉發(fā)病率和產(chǎn)量顯著相關(guān)（Garbeva et al.，2004;Raaijmakers et al.，2009; Zhang et al.，2011;Phili-ppot et al.，2013;Wang et al.，2016），因此，研究土壤細(xì)菌群落的多樣性對(duì)維持土壤健康和抑制植物病害具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】黃珍等（2010）對(duì)海南省福山香蕉園香蕉枯萎病發(fā)生地和正常種植園的土壤樣品進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)正常香蕉種植區(qū)土壤樣品的細(xì)菌多樣性較豐富，其中變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和酸桿菌門(mén)為主要細(xì)菌類(lèi)群，而香蕉枯萎病發(fā)生地土壤以放線菌門(mén)（Actinobacteria）和厚壁菌門(mén)（Firmicutes）為主要細(xì)菌類(lèi)群。付琳等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)生物有機(jī)肥處理后微生物群落結(jié)構(gòu)變得更加優(yōu)化，可提高香蕉抵抗病原菌的能力。鄧曉等（2015）在對(duì)香蕉健康植株和患病植株根際細(xì)菌群落多樣性的比較中發(fā)現(xiàn)，患病植株根際的細(xì)菌多樣性小于健康植株根際的細(xì)菌多樣性。鐘書(shū)堂等（2015）發(fā)現(xiàn)連續(xù)兩年施用生物有機(jī)肥可明顯降低尖孢鐮刀菌數(shù)量，使蕉園土壤可培養(yǎng)微生物群落結(jié)構(gòu)更加均衡，實(shí)現(xiàn)對(duì)香蕉枯萎病的防效提升和產(chǎn)量及果實(shí)品質(zhì)的提高。Shen等（2015）通過(guò)連續(xù)兩年施用微生物肥料發(fā)現(xiàn)，土壤細(xì)菌多樣性和微生物群落結(jié)構(gòu)得到優(yōu)化，從而降低了香蕉枯萎病的發(fā)病率?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，針對(duì)香蕉枯萎病的研究主要集中在患病蕉園和健康蕉園土壤微生物群落多樣性的差異上，對(duì)在患病蕉園施入生防菌劑后土壤細(xì)菌群落的變化特征研究甚少?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用大田區(qū)組試驗(yàn)，利用Illumina Hiseq 2500高通量測(cè)序平臺(tái)，研究生防菌XP1接種土壤后對(duì)香蕉根際土壤細(xì)菌群落多樣性的影響，探索生防菌防治香蕉枯萎病的土壤微生物學(xué)機(jī)制，以期為利用生防菌劑防控香蕉枯萎病提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于廣東省湛江市徐聞縣邁陳鎮(zhèn)那種基地（東經(jīng)110°10′17.90″，北緯20°19′39.90″），氣候類(lèi)型為熱帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫23.5 ℃，年平均降水量1364 mm。試驗(yàn)區(qū)為連續(xù)8年種植韭菜的平整地塊，土壤類(lèi)型為磚紅壤，土壤理化性質(zhì)為有機(jī)質(zhì)14.4 g/kg、堿解氮62.3 mg/kg、有效磷（P2O5）38.0 mg/kg、速效鉀（K2O）108.6 mg/kg、pH 5.6。

1. 2 試驗(yàn)材料

供試香蕉品種：巴西蕉（Cavendish，cv. Brazilium AAA，香蕉枯萎病感病品種）組培苗。供試病原菌：帶有標(biāo)記綠色熒光蛋白的香蕉枯萎病菌4號(hào)生理小種（簡(jiǎn)寫(xiě)GFP-FOC4），由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所李春雨博士饋贈(zèng)，致病性與野生型菌株一致。供試生防菌：解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）XP1，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所提供。XP1培養(yǎng)條件：利用PDA和LB混合培養(yǎng)基在28 ℃的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)5 d，抑菌圈直徑為62.5 mm（孫杰，2018）;PDA和LB混合培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g、葡萄糖（C6H12O6·H2O）20 g、胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、蒸餾水1000 mL。

主要試劑：MOBIO PowerSoil? DNA Isolation Kit試劑盒（貨號(hào)12888-100）購(gòu)自北京寶杰羅生物科技有限公司（MOBIO）;Premix Taq（E×Taq Version 2.0 Plus）（貨號(hào)RR902A）、DL15000 DNA Marker（貨號(hào)3582A）、100 bp DNA Ladder（貨號(hào)3422A）和DL2000 DNA Marker（貨號(hào)3247A）購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司（TaKaRa）;Primer（訂購(gòu)合成）和Quant-iTTM Broad-Range DNA Assay（貨號(hào)Q32853）購(gòu)自美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司（Invitrogen）;瓊脂糖（貨號(hào)111860）購(gòu)自廣州浩瑪生物科技有限公司。主要儀器：PCR擴(kuò)增儀（型號(hào) ABI9600，美國(guó)）和Daek reader（型號(hào)DR-46B）購(gòu)自Clare Chemical Research;QubitTM Fluorometer（型號(hào)Qubit? 2.0 Fluorometer）購(gòu)自Invitrogen公司;微型離心機(jī)（型號(hào)Baygene BG-Qspin#8482）購(gòu)自Baygene;渦旋混合器（型號(hào)QL-901）購(gòu)自其林貝爾儀器制造有限公司;凝膠成像儀（型號(hào)Tanon 4100）購(gòu)自上海天能科技有限公司。

1. 3 試驗(yàn)方法

1. 3. 1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理，每處理3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列，共9個(gè)小區(qū)，小區(qū)面積223 m2。其中，CK：健康蕉園+每株0.5 L滅菌PDA培養(yǎng)基灌根+每株0.5 L滅菌LB培養(yǎng)基灌根;DI：健康蕉園+香蕉枯萎病菌（菌液濃度1×109個(gè)/mL，接種量0.5 L/株）+每株0.5 L滅菌LB培養(yǎng)基;TR：健康蕉園+香蕉枯萎病菌（菌液濃度1×109個(gè)/mL，接種量0.5 L/株）+生防菌（菌液濃度1×109個(gè)/mL，接種量0.5 L/株）。

香蕉枯萎病菌采用灌根法在香蕉7～8片葉、株高40～50 cm時(shí)接種。TR處理生防菌劑是在香蕉枯萎病菌接種后24 h灌根。香蕉種植密度為60株/223 m2，起壟種植，株行距1.5 m×2.5 m。

1. 3. 2 根際土壤采集方法 土壤樣品于DI處理小區(qū)95%香蕉植株出現(xiàn)發(fā)病癥狀時(shí)進(jìn)行采集（約移栽后100 d）。參照Z(yǔ)hao等（2016）的根際土壤采集方法，在每小區(qū)按發(fā)病重度、中度、輕度各采取4株完整植株根際土壤。將采集的根際土壤混合均勻，分成兩份，一份約2000 g室溫保存，用于土壤理化性質(zhì)測(cè)定;一份約500 g放入無(wú)菌密封袋裝入冰盒，帶回實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存，用于細(xì)菌群落多樣性分析。

1. 3. 3 理化性質(zhì)測(cè)定方法 土壤pH采用pH計(jì)、全磷采用鉬銻抗比色法、全氮采用半微量凱氏定氮法、堿解氮采用堿解擴(kuò)散法進(jìn)行測(cè)定（鮑士旦，1999）;土壤速效磷和速效鉀分別采用碳酸氫鈉浸提鉬銻抗比色法和乙酸銨浸提火焰光度法進(jìn)行測(cè)定（張甘霖和龔子同，2012）;硝態(tài)氮和銨態(tài)氮采用流動(dòng)注射分析法進(jìn)行測(cè)定。

1. 3. 4 防效調(diào)查 參照張志紅等（2008）的方法將香蕉枯萎病發(fā)病情況分為5個(gè)等級(jí)：0級(jí)，植株無(wú)枯黃癥狀;1級(jí)，植株下部葉片出現(xiàn)輕微的枯黃癥狀，嫩葉完好，少部分根系輕微褐變，莖部出現(xiàn)水漬狀褐變;2級(jí)，植株下部葉片出現(xiàn)明顯的枯黃癥狀，但嫩葉完好，根系出現(xiàn)褐變，莖部和假莖部出現(xiàn)水漬狀褐變;3級(jí)，整株植株出現(xiàn)枯黃癥狀，根系褐變腐爛，莖部和假莖部褐變連片，少數(shù)葉柄出現(xiàn)紅褐;4級(jí)，植株出現(xiàn)枯萎死亡癥狀，根系嚴(yán)重褐變腐爛。收獲期調(diào)查香蕉枯萎病發(fā)病率和病情指數(shù)，參考Xu等（2004）的方法統(tǒng)計(jì)香蕉發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果。

發(fā)病率（%）=發(fā)病的植株數(shù)/處理植株總數(shù)×100

病情指數(shù)=∑各級(jí)發(fā)病數(shù)×該級(jí)代表數(shù)/總數(shù)×最高級(jí)代表值×100

防病效果（%） =（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100

1. 3. 5 土壤總DNA提取 采用土壤DNA提取試劑盒（MOBIO PowerSoil? DNA Isolation Kit）對(duì)土壤樣品進(jìn)行總DNA提取，每個(gè)土樣設(shè)置3個(gè)重復(fù)，最后把提取的所有DNA混合成一個(gè)樣品。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度。

1. 3. 6 擴(kuò)增及產(chǎn)物電泳檢測(cè) 采用通用引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和806R（5'-GGACTACNVGGGTWTCTAA-3'）對(duì)細(xì)菌16S rDNA高變區(qū)V4區(qū)進(jìn)行目標(biāo)片段擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系50 μL：2×PCR Mix 25 μL，20 ng/μL DNA模板3 μL，10 mmol/L正、反向引物各1 μL，ddH2O 20 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，擴(kuò)增完成后將同一樣本的PCR產(chǎn)物進(jìn)行混合。PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)：用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度和濃度，篩選出主帶長(zhǎng)度在正常范圍內(nèi)（16S V4：290～310 bp）的樣品。

1. 3. 7 Pooling及切膠純化 按照等質(zhì)量原則，利用GeneTools Analysis Software（Version 4.03.05.0，SynGene）計(jì)算各樣品PCR產(chǎn)物所需體積后進(jìn)行混合，并使用EZNA Gel Extraction Kit（OMEGA，USA）凝膠回收試劑盒回收目標(biāo)片段。

1. 3. 8 建庫(kù)及測(cè)序 按照NEBNext? UltraTM DNA Library Prep Kit for Illumina?（New England Biolabs，USA）標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行建庫(kù)，并對(duì)研究構(gòu)建的擴(kuò)增子文庫(kù)采用 Illumina Hiseq 2500平臺(tái)進(jìn)行PE250測(cè)序。

1. 3. 9 數(shù)據(jù)處理 分別利用Mothur（Schloss et al.，2009）、Flash（Mago? and Salzberg，2011）和Trimmomatic（Bolger et al.，2014）對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制及過(guò)濾，得到有效的拼接片段（Clean Tags）。

1. 3. 10 序列處理與分析 利用Usearch以97%的默認(rèn)相似性將序列聚類(lèi)成為一個(gè)OTU（Operational taxonomic units），再與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)及物種注釋。

（1）菌群豐富度（Species richness）指數(shù)計(jì)算方法（只考慮物種數(shù)量）：

a. Chao1-the Chao1 estimator：用Chao1算法估計(jì)樣本中所含OTU數(shù)目的指數(shù)（Liu et al.，2014）。

Schao1=Sobs+[n1（n1+1）2（n2+1）]

其中，Schao1：估計(jì)的OTU數(shù)目;Sobs：實(shí)際觀測(cè)到的OTU數(shù)目;n1：只含有一條序列的OTU數(shù)目（singletons）;n2：只含有兩條序列的OTU數(shù)目（doubletons），以此類(lèi)推。

b. Observed species：指樣本中實(shí)際測(cè)定得到的OTU數(shù)目，可間接反映樣品中物種的豐富程度（Chaparro et al.，2014）。

（2）菌群多樣性（Species diversity）指數(shù)計(jì)算方法：

a. Dominance指數(shù)：表示隨機(jī)取兩條序列，來(lái)自同一個(gè)物種的概率。

Ddominance=[p2i]

其中，pi代表OTU（i）在全部OTU中的比例。Dominance 也可定義為1-Simpson’s index。其值在0～1之間。

b. Shannon指數(shù)：香農(nóng)—維納指數(shù)（Shannon-Wiener index）（Yates et al.，2012），用來(lái)估算樣本中微生物多樣性指數(shù)之一，值越大說(shuō)明群落多樣性越高。

Hshannon=[-i=1SobsniNlnniN]

其中，Sobs：實(shí)際測(cè)量出的OTU數(shù)目;ni：含有i條序列的OTU數(shù)目;N：所有序列數(shù)。

c. Simpson指數(shù)：辛普森指數(shù)（Simpson’s diversity index）（Liu et al.，2014）用來(lái)估算樣品中微生物的多樣性指數(shù)之一，Simpson 指數(shù)值越大，說(shuō)明群落多樣性越高。

Dsimpson=1-[i=1Sobsnini-1NN-1]

其中，Sobs：實(shí)際觀測(cè)到的OTU數(shù)目;ni：含有i條序列的OTU數(shù)目;N：所有序列數(shù)。

1. 4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 Excel 2016進(jìn)行整理并制圖，采用IBM SPAS Statistics 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用R軟件進(jìn)行Venn圖繪制和Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析;基于OTU相對(duì)豐度，利用QIIME軟件包中的Alpha-rarefaction腳本進(jìn)行Observed-species指數(shù)稀釋曲線數(shù)據(jù)計(jì)算，然后利用R軟件繪制稀釋曲線;基于3種Beta多樣性距離矩陣，使用qiime2和ggplot2軟件包進(jìn)行PCoA分析并繪圖?；诰换腛TU豐度，使用R軟件vegan包的anosim函數(shù)進(jìn)行Anosim分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 生防菌XP1對(duì)香蕉枯萎病的防治效果

由表1可知，CK處理香蕉植株無(wú)發(fā)病現(xiàn)象;DI處理在接種香蕉枯萎病菌GFP-FOC4后蕉園的發(fā)病率高達(dá)95.0%，病情指數(shù)為68.3;TR處理接種生防菌XP1后蕉園的發(fā)病率為13.3%，與DI處理相比差異達(dá)極顯著水平（P<0.01，下同），病情指數(shù)降低至10.8，防治效果顯著，達(dá)84.2%。TR處理香蕉枯萎病發(fā)病率較DI處理降低81.7%（絕對(duì)值），說(shuō)明生防菌對(duì)香蕉枯萎病菌具有較強(qiáng)的拮抗作用。

2. 2 Observed species指數(shù)分析結(jié)果

共測(cè)序獲得886890個(gè)序列，在97%的相似水平下聚類(lèi)后獲得61660個(gè)OTUs。測(cè)序結(jié)果顯示，3個(gè)樣品的所有優(yōu)質(zhì)序列經(jīng)聚類(lèi)注釋后歸屬于40個(gè)菌門(mén)。從圖1可看出，當(dāng)測(cè)序深度達(dá)80000個(gè)序列時(shí)，各處理的Observed species指數(shù)曲線趨向平緩，上升速度減緩，說(shuō)明測(cè)序深度已基本覆蓋樣品中絕大部分物種;在同等測(cè)序深度上，無(wú)發(fā)病現(xiàn)象的CK處理實(shí)際觀測(cè)到的物種數(shù)最多，當(dāng)測(cè)序深度達(dá)70000個(gè)序列時(shí)，接種致病菌的DI處理實(shí)際觀察到的物種數(shù)低于CK處理、高于TR處理，隨測(cè)序深度的加大，接種生防菌的TR處理其實(shí)際觀測(cè)到的物種數(shù)略高于DI處理、低于CK處理。

2. 3 OTU聚類(lèi)分析結(jié)果

由圖2可看出，CK、DI和TR處理分別有8163、7039和6944個(gè)OTUs，其中，CK與DI處理共有4596個(gè)OTUs，CK與TR處理共有5546個(gè)OTUs，DI與TR處理共有4190個(gè)OTUs。三者的OTUs數(shù)量表現(xiàn)為CK>DI>TR，說(shuō)明CK處理中的微生物種類(lèi)最豐富，DI次之，TR處理中的微生物種類(lèi)最少。由各處理間共有的OTUs數(shù)量可知，CK與TR處理的共有物種種類(lèi)較多，DI與TR處理共有的物種種類(lèi)最少，說(shuō)明TR處理經(jīng)過(guò)生防菌作用后細(xì)菌群落內(nèi)部的物種種類(lèi)與無(wú)發(fā)病狀況的健康土壤物種種類(lèi)更接近。

2. 4 Alpha多樣性指數(shù)分析結(jié)果

為保證各處理在同一測(cè)序深度，所有序列進(jìn)行均一化處理后所得的Alpha多樣性參數(shù)如下表2所示。由表2可知，DI處理除Dominance指數(shù)略大于CK處理外，Chao1指數(shù)、Observed species指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)分別比CK小869.6、817、0.001和0.375，表明GFP-FOC4在根際定殖后降低了土壤細(xì)菌群落的多樣性和豐度。TR處理的Dominance指數(shù)顯著大于DI和CK處理，說(shuō)明TR處理細(xì)菌物種的分布較DI和CK處理更集中;TR處理的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均顯著低于CK和DI處理，說(shuō)明TR處理的細(xì)菌群落多樣性和群落均勻性小于CK和DI處理;TR處理的Chao1指數(shù)和Observed species指數(shù)大于DI處理、小于CK處理，說(shuō)明TR處理中實(shí)際觀察到的細(xì)菌物種數(shù)量大于DI處理、小于CK處理。接種生防菌后，TR處理的Chao1指數(shù)和Observed species指數(shù)與DI處理相比分別提高7.3%和0.7%，香蕉根際土壤中的細(xì)菌物種豐度得到有效提高。

2. 5 門(mén)水平上細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成分析結(jié)果

各樣品相對(duì)豐度≥1%的菌門(mén)組成情況見(jiàn)圖3。由圖3可知，變形菌門(mén)（Proteobacteria）是CK、DI和TR處理的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，分別占各自相對(duì)豐度≥1%物種的32.21%、28.94%和53.78%，且TR與CK和DI處理間達(dá)顯著差異水平（P<0.05，下同）;酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）在CK、DI和TR處理中的比重有依次減少的趨勢(shì);擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）和放線菌門(mén)（Actinobacteria）在DI處理中的比重最大，在TR處理中的比重最小;硝化螺旋菌門(mén)（Nitrospirae）、浮霉菌門(mén)（Planctomycetes）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）和OD1等在CK處理中的比重均略大于其他兩個(gè)處理。綜上，蕉園發(fā)病后降低了硝化螺旋菌門(mén)、變形菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、OD1和浮霉菌門(mén)的豐度，接種生防菌后變形菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、OD1和硝化螺旋菌門(mén)的相對(duì)豐度有回升趨勢(shì);發(fā)病后增加了厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)和疣微菌門(mén)的豐度，生防菌劑處理后上述菌門(mén)的相對(duì)豐度均有所下降;變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、浮霉菌門(mén)、放線菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、OD1、硝化螺旋菌門(mén)和疣微菌門(mén)是3個(gè)處理共有的菌門(mén)種類(lèi)。

2. 6 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與根際土壤環(huán)境因子的冗余分析（RDA）結(jié)果

利用細(xì)菌群落特征和土壤因子數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行冗余分析可綜合反映土壤因子與細(xì)菌群落間的關(guān)系及相關(guān)程度。圖4中軸1和軸2分別解釋了細(xì)菌群落構(gòu)成與環(huán)境變量間關(guān)系的84.23%和14.33%，兩軸共解釋了98.56%，較好地解釋了細(xì)菌群落特征與根際土壤理化性質(zhì)間的關(guān)系。從圖4可看出，變形菌門(mén)與pH間呈正相關(guān)，與其他理化指標(biāo)間呈負(fù)相關(guān);酸桿菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、OD1、浮霉菌門(mén)、硝化螺旋菌門(mén)、疣微菌門(mén)與全磷（Total phosphorus）含量、速效磷（Available phosphorus）含量、速效鉀（Avai-lable potassium）含量、全氮（Total nitrogen）含量、堿解氮（Alkaline nitrogen）含量間呈正相關(guān)，與pH、銨態(tài)氮（Ammonium nitrogen）含量、硝態(tài)氮（Nitrate nitrogen）含量間呈負(fù)相關(guān);厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)與銨態(tài)氮含量、硝態(tài)氮含量間呈正相關(guān)，與其他理化指標(biāo)間呈負(fù)相關(guān)。

2. 7 樣品組間主坐標(biāo)分析結(jié)果

從基于加權(quán)的主坐標(biāo)分析結(jié)果（圖5）可看出，第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）是造成3組樣品差異的兩個(gè)最大特征，貢獻(xiàn)率分別為67.02%和27.05%，兩者共解釋了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異的94.07%。CK與DI處理在PC2軸上相距較遠(yuǎn)，說(shuō)明致病菌FOC4-GFP施入土壤后改變了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu);DI與TR處理在PC1軸上相距較遠(yuǎn)，說(shuō)明接入致病菌FOC4-GFP再施入生防菌XP1后，改變了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu);CK與TR處理在PC1和PC2軸上均有一定距離，說(shuō)明TR與CK處理間細(xì)菌群落構(gòu)成差異明顯。各處理重復(fù)間相距較近，處理間距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明各處理內(nèi)部間群落結(jié)構(gòu)相似性較高，各處理間群落結(jié)構(gòu)差異明顯。

2. 8 組間群落結(jié)構(gòu)差異顯著性分析結(jié)果

從Anosim相似性分析結(jié)果（表3）可知，3個(gè)處理間的R為1，說(shuō)明CK、DI和TR處理組間差異大于組內(nèi)差異，與PCoA分析結(jié)果一致，且統(tǒng)計(jì)分析的可信度P為0.003，小于0.05，表明統(tǒng)計(jì)具有較高的可信度。

3 討論

近年來(lái)，由于連作、施肥不當(dāng)和線蟲(chóng)危害等導(dǎo)致的土傳病害越來(lái)越普遍，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)重大經(jīng)濟(jì)損失。研究發(fā)現(xiàn)，土傳病害的發(fā)生主要與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)失衡、生態(tài)環(huán)境惡化等有關(guān)（van Bruggen and Semenov，2000）。生物防治是目前用于防控香蕉枯萎病最受歡迎的一種綠色安全措施，其原理是利用生防菌來(lái)抑制病原菌的繁殖和增長(zhǎng)，從而使土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)維持均衡。

本研究的試驗(yàn)地是8年連作韭菜地，韭菜殘留物含有的2-甲基-2-戊烯醛、2-甲基-3-硫醚和2-丙基-3-硫醚等成分可有效抑制田間香蕉枯萎病的發(fā)生（王彤，2018）。本研究發(fā)現(xiàn)未接種病原菌GFP-FOC4和生防菌XP1的CK處理大田無(wú)香蕉植株發(fā)病現(xiàn)象;接入病原菌后，香蕉枯萎病的發(fā)病率高達(dá)95.0%，說(shuō)明尖孢鐮刀菌已入侵到香蕉植株體內(nèi)，導(dǎo)致香蕉維管束壞死;接種生防菌解淀粉芽孢桿菌后，香蕉枯萎病發(fā)病率由95.0%下降到13.3%，防效極顯著。究其原因：一是解淀粉芽孢桿菌作為一種生防菌，在其生長(zhǎng)過(guò)程中能產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，具有廣泛抑制真菌的功能（Yuan et al.，2013）;二是一些土傳植物病原菌通常是從宿主根部的傷口或在初生根和次生根的交界處開(kāi)始入侵，而生防菌對(duì)這些根際重要生態(tài)位點(diǎn)的占領(lǐng)可有效防止病原菌對(duì)植物根系的侵襲（Compant et al.，2005;Timmusk et al.，2005;Zhou et al.，2018）。

已有大量研究報(bào)道土傳病害會(huì)引起作物根際土壤中微生物多樣性和均勻性降低。Gorissen等（2004）在對(duì)馬鈴薯青枯病的研究中發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯患病后其植株根際土壤細(xì)菌多樣性明顯小于健康植株根際土壤。鄧曉等（2015）比較了香蕉健康植株與患病植株根際細(xì)菌群落的多樣性，發(fā)現(xiàn)患病植株根際細(xì)菌多樣性小于健康植株根際的細(xì)菌多樣性。肖蓉等（2017）通過(guò)高通量測(cè)序比較患炭疽病草莓與健康草莓根際土壤細(xì)菌群落多樣性，發(fā)現(xiàn)發(fā)病草莓根際土壤的細(xì)菌群落豐富度和多樣性均小于健康植株根際土壤。本研究中，DI處理的Chao1指數(shù)、Observed species指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均小于CK處理，說(shuō)明植株發(fā)病后其根際土壤細(xì)菌多樣性和豐富度均較健康植株根際土壤有所減少;健康植株根際土壤（CK）有更豐富的微生物群落構(gòu)成，且微生物多樣性和豐富度均較高;在接種病原菌的基礎(chǔ)上接入生防菌的TR處理，其Chao1指數(shù)和Observed species指數(shù)較DI處理均有所提高，說(shuō)明接入生防菌后可增加土壤中細(xì)菌的豐富度，很大程度上能阻控物種豐富度不斷減小的趨勢(shì)。

本研究對(duì)細(xì)菌群落組成的分析發(fā)現(xiàn)，變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、浮霉菌門(mén)、放線菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、OD1、硝化螺旋菌門(mén)和疣微菌門(mén)是3個(gè)處理共有的11個(gè)菌門(mén)，變形菌門(mén)、酸桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)是3個(gè)處理共有的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，其中變形菌門(mén)在TR處理中所占的比重最高，為53.78%。也有研究表明，變形菌門(mén)中有很多對(duì)植物生長(zhǎng)有益的細(xì)菌，其存在與增殖對(duì)土壤能量平衡起重要作用（翟婉璐等，2017）。因此，本研究中盡管接種生防菌的TR處理Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)并未提高，但細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變得更加優(yōu)化。李冬麗等（2011）對(duì)海南省臨寶縣南寶鎮(zhèn)健康土樣和香蕉枯萎病發(fā)病程度高達(dá)80%的土樣進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩種土樣均以厚壁菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、變形菌門(mén)、黃桿菌門(mén)、綠灣菌門(mén)和螺旋菌門(mén)為主要類(lèi)群。鄧曉等（2015）通過(guò)對(duì)海南香蕉枯萎病患病植株根際和健康植株根際土壤微生物群落特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)健康植株和發(fā)病植株根際土壤的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)均為厚壁菌門(mén)，分別高達(dá)64%和75%。本研究結(jié)果與李冬麗等（2011）、鄧曉等（2015）的研究結(jié)果基本一致，但本研究識(shí)別的菌門(mén)種類(lèi)更多、分類(lèi)更詳細(xì)，且優(yōu)勢(shì)菌門(mén)種群與李冬麗等（2011）、鄧曉等（2015）的研究結(jié)果有所不同，推測(cè)是土壤樣品來(lái)源和自然環(huán)境不同所致。

PCoA分析結(jié)果表明，CK和TR處理的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性大于DI和TR處理，說(shuō)明患病蕉園施用解淀粉芽孢桿菌XP1后，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)逐漸向健康土壤的方向演替，其原因是生防菌改善了微生物菌群間的相互關(guān)系。Saravanan等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，在香蕉根際接種熒光假單孢菌后，熒光假單孢菌大量定殖，進(jìn)而取代了病原真菌的生態(tài)位，成為根際優(yōu)勢(shì)菌群，聯(lián)合根際拮抗菌代謝物質(zhì)共同抑制病原菌的生長(zhǎng)。冗余分析結(jié)果顯示，軸1和軸2共解釋了98.56%的群落差異性，說(shuō)明所選理化指標(biāo)能較好地分析微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子間的相關(guān)性。牛世全等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，pH與擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)呈正相關(guān);速效鉀含量與綠彎菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)、浮霉菌門(mén)、酸桿菌門(mén)和疣微菌門(mén)成正相關(guān)。本研究結(jié)果與之大致相同，不同的是銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量分別與擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)呈正相關(guān)。本研究中，酸桿菌門(mén)與土壤全氮和堿解氮含量呈正相關(guān)，與Magill和Aber（2000）對(duì)森林土壤研究得出的土壤中氮含量的增加會(huì)使酸桿菌門(mén)的多樣性增加相符合。

4 結(jié)論

患病蕉園接種生防菌XP1后，XP1能在香蕉根際土壤中定殖和增殖，并通過(guò)改善香蕉根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征，提升細(xì)菌群落物種豐富度和有益菌比例，有效阻控病原菌在香蕉根際的定殖和增殖，使香蕉枯萎病發(fā)病率顯著降低，具有一定的應(yīng)用潛力。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）